南通骨頭PCR檢測技術服務

所謂real-timeQ-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監(jiān)測反應全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發(fā)展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團。南通骨頭PCR檢測技術服務

引物的設計注意事項：1，引物設計要跨內(nèi)含子，不能在一個外顯子上（我們的實驗是以cDNA為模板來擴增的，如果有DNA污染的話，因為DNA上含有分子量很大的內(nèi)含子，不可能完成擴增。這對我們消除整個實驗的誤差起很大的作用）。2，引物設計的時候要盡可能設計在同一退火溫度，方便于以后同時擴增很多不同的基因片段。但是如果相差比較大，就得分開做，浪費模板，浪費管家基因，所以每個實驗室設計引物的時候要盡可能一致，這樣就不用每次查退火溫度，且對整個實驗有利。廈門微量PCR檢測技術方案實時熒光定量PCR法較大的優(yōu)點是克服了終點PCR法進入平臺期或叫飽和期后定量的較大誤差。

Real-time PCR從用途上分可以分為定性分析和定量分析：定量分析可以分為定量和相對定量兩種。定量指的是我們想知道某個基因在初始樣品中具體的拷貝數(shù)或濃度是多少？定量實驗必須使用已知拷貝數(shù)的標準品，必須做標準曲線。而相對定量是指我們想知道某一個基因在不同樣品中表達量的差異，其目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數(shù)。舉例來說，如研究項目中包括使用高鹽脅迫處理的樣本和未高鹽脅迫處理的樣本，記為已處理樣本和未處理樣本，通?？梢詫⑽刺幚順颖局付榛鶞剩?guī)定其目的基因濃度為100%，用已處理樣本的定量結果除以未處理樣本的定量結果，就可以計算每個已處理樣本的基因含量相對于未處理樣本的百分比。相對定量可以應用于差異顯示結果驗證、基因芯片結果驗證、siRNA效果確認、mRNA表達量分析等等。

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內(nèi)參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內(nèi)參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。電子PCR被提出作為分子生物學的教育工具。

引物的設計對于這個實驗至關重要，因為Real-time PCR的檢測靈敏度比較高，所以相應的對引物設計的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道，還有幾點必須注意：1，引物的錯配率（引物錯配形成引物二聚體，但是SYBR照樣能嵌入進去，結果導致實驗結果的誤差很大，重復性也不好）。2，引物的特異性一定要高（不像常規(guī)PCR，引物同源性不高，只要兩條產(chǎn)物的片段長度相差足夠大，在電泳的時候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時候能分開，所以這就造成整個實驗結果誤差很大，不可信）。實時定量PCR通用電腦，自動分析軟件等構成。南通骨頭PCR檢測技術服務

基于探針的化學法，Real-time PCR應用一個或多個熒光標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產(chǎn)物。南通骨頭PCR檢測技術服務

Real-time PCR鏈反應的常見問題分析與解決方法：反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。引物量過多。減少反應體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對工作臺進行清潔。模板或引物使用錯誤。更換引物和模板。基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。逆轉錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉錄物的序列。南通骨頭PCR檢測技術服務

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