溫州細胞數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈反應的常見問題分析與解決方法：擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶(雜帶)：引物用量偏大，引物的特異性不高。應調(diào)換引物或降低引物的使用量。循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量，減少循環(huán)次數(shù)。酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶。退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度。 樣品處理不當。Mg2+濃度偏高，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度。若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成。溫州細胞數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈式反應的特點：特異性強，PCR反應的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結(jié)合（復性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)合的特異性增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。溫州細胞數(shù)字PCR原理逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應較廣用于表達譜，以確定基因的表達或鑒定RNA轉(zhuǎn)錄物的序列。

絕大多數(shù)聚合酶鏈反應方法依賴于熱循環(huán)。熱循環(huán)將反應物暴露于加熱和冷卻的重復循環(huán)中，以允許不同的溫度依賴性反應——具體地說，脫氧核糖核酸融化和酶-驅(qū)動DNA復制。聚合酶鏈反應使用兩種主要試劑-引物(引物是短的單鏈DN段，稱為寡核苷酸，是目標DNA區(qū)域的互補序列)和DNA聚合酶。在PCR反應的步，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的兩條鏈在高溫下物理分離，這個過程稱為脫氧核糖核酸變性。第二步，降低溫度，引物與互補的脫氧核糖核酸序列結(jié)合。這兩條DNA鏈就變成了模板，以酶促的方式從構(gòu)成DNA的自由核苷酸中組裝出一條新的DNA鏈。隨著聚合酶鏈反應的進行，產(chǎn)生的DNA本身被用作復制的模板，啟動了一個連鎖反應，原始的DNA模板是以指數(shù)形式放大。

聚合酶鏈式反應：定量PCR允許實時定量和檢測特定的DNA序列，因為它在合成過程中測量濃度。有兩種方法可以同時檢測和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標記的探針。只有在探針與其互補DNA雜交后，才能使用這些方法檢測DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實時PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR，允許定量少量RNA。通過這種組合技術(shù)，mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA，并用qPCR進一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應終點出錯的可能性，增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機會。實驗室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控。重疊延伸聚合酶鏈反應可以創(chuàng)造特定的長DNA構(gòu)建體。

聚合酶鏈式反應的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復制完成。南通血液PCR檢測技術(shù)哪家好

多重連接依賴探針擴增允許用單個引物對擴增多個靶標，從而避免多重PCR的分辨率限制。溫州細胞數(shù)字PCR原理

聚合酶鏈式反應的試驗污染：PCR反應的很大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。 污染原因：標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。溫州細胞數(shù)字PCR原理