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PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。pcr檢測實(shí)驗(yàn)成功的訣竅！新疆常見pcr哪家好

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的高GC含量PCR（GC-richPCR）介紹：具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強(qiáng)氫鍵影響，比較難以擴(kuò)增。高GC含量序列同時也涉及二級結(jié)構(gòu)。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴(kuò)增時卡住，從而影響了DNA的合成。為了擴(kuò)增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結(jié)合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強(qiáng)GC相互作用，較常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性（圖6A），如DMSO。這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應(yīng)的調(diào)整。高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強(qiáng)結(jié)合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴(kuò)增（圖6B）。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴(kuò)增，因?yàn)楦叩淖冃詼囟龋ㄈ?8℃代替95℃）可促進(jìn)解鏈和PCR擴(kuò)增。安徽pcr價格英瀚斯生物，專業(yè)分子檢測平臺，高質(zhì)量pcr檢測。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的多重PCR（MultiplexPCR））介紹：多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時擴(kuò)增多個不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時間、試劑和樣本，同時使得多個擴(kuò)增子進(jìn)行同時比較成為可能。當(dāng)一個反應(yīng)管中存在多個引物對時，如在多重PCR中，非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是較關(guān)注的問題，因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對所有的引物對和片段。因此，引物的設(shè)計至關(guān)重要，以減少錯配引起的非特異性擴(kuò)增。引物序列對于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的，且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前，每個引物對應(yīng)在單個反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且，不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開，以便鑒定。除了引物設(shè)計和擴(kuò)增子大小，熱啟動DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對于多重PCR也是必需的，它們可有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。

PCR的特異性影響因素有很多，在此我們作一歸納，供大家參考：①退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。②減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。③引物二聚體是較常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。④改變mgcl2(有時kcl)濃度可以改進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對taq酶的直接作用。一般認(rèn)為PCR產(chǎn)物應(yīng)在48h以內(nèi)完成電泳檢測，有些比較好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型就會出現(xiàn)不規(guī)則，甚至消失。pcr檢測知識要點(diǎn)總結(jié)匯總。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的Touch-downPCR介紹：Touch-downPCR又稱降落PCR.即選定一個溫度范圍，如50—35℃，每降1-2℃進(jìn)行1-2個循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個循環(huán)。Touch-down的原理隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。選擇初始復(fù)性溫度的原則起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度Touch-downPCR的應(yīng)用范圍lowcopyoftargetedDNA;highdegreedegeneracy(orlessspecific)ofthefirstsetofprimers;做pcr檢測，需要注意哪些事項？黑龍江細(xì)胞pcr實(shí)驗(yàn)

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PCR方法主要可以分為三類：終點(diǎn)PCR、qPCR和dPCR。終點(diǎn)PCR終點(diǎn)PCR是較原始、較簡單的PCR方法，如今仍在被我們普遍使用。使用者只能在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等方法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。終點(diǎn)PCR本身是無法定量的，因?yàn)樵摲磻?yīng)產(chǎn)出的DNA量不一定能反映較初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴(kuò)增效率是有差異的。qPCR和dPCR研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰(zhàn)：實(shí)時定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監(jiān)控PCR過程中的熒光強(qiáng)度比較多個樣品的DNA水平。數(shù)字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)較多只含有一個模板。然后通過計數(shù)正負(fù)反應(yīng)來確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。新疆常見pcr哪家好

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