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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的反向PCR（InversePCR）介紹：反向PCR起初設(shè)計(jì)用于確定臨近未知區(qū)域的序列。反向PCR有助于研究一個(gè)基因的啟動(dòng)子序列；致*染色體重排如基因融合、異位或轉(zhuǎn)移；及病毒基因的整合。之所以稱為反向PCR，是因?yàn)橐镌O(shè)計(jì)用于向兩邊延伸而不像常規(guī)PCR中朝著彼此延伸。如今，反向PCR常用于定點(diǎn)突變，復(fù)制一個(gè)具有預(yù)期突變的目的質(zhì)粒。在研究基因組DNA未知序列的傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)流程中，限制性內(nèi)切酶消化和連接先于反向PCR，接著對(duì)PCR擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于gDNA消化，需選擇一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切以獲得合適長(zhǎng)度可自連的片段。同時(shí)，所選擇的內(nèi)切酶不應(yīng)該切割已知序列，所以連接發(fā)生于側(cè)翼的未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA的片段以助于片段自連而非多個(gè)片段連接。片段自連完成后，通過(guò)反向PCR擴(kuò)增DNA的位置區(qū)域。獲得的擴(kuò)增子兩端包含一部分已知序列。之后通過(guò)測(cè)序以鑒定臨近已知序列的未知區(qū)域。pcr檢測(cè)實(shí)驗(yàn)有哪些分類？甘肅組織pcr哪家好

PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過(guò)程就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍陜西細(xì)胞pcr要多久英瀚斯生物，專業(yè)儀器，豐富經(jīng)驗(yàn)，高質(zhì)量pcr。

PCR引物設(shè)計(jì)的原則PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5′端引物和3′引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ)。（1）引物設(shè)計(jì)的基本原則引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC比較好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過(guò)70%，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，比較好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點(diǎn)介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡(jiǎn)化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測(cè)非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測(cè)出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時(shí)RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。pcr儀的使用說(shuō)明是什么？

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)介紹：連接酶鏈反應(yīng)(Ligasechainreaction，LCR)，是一種新的DNA體外擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)，主要用于點(diǎn)突變的研究及靶基因的擴(kuò)增。連接酶鏈反應(yīng)是Backman1997年為檢出靶基因序列中的點(diǎn)突變而設(shè)計(jì)發(fā)明，并申報(bào)了**。1988年Landegren也進(jìn)行了該項(xiàng)研究。1988年Backman等又因分離熱穩(wěn)定的連接酶，1991年Backman和Barany分別用耐熱DNA連接酶進(jìn)行了LCR試驗(yàn)。耐熱DNA連接酶可以在熱循環(huán)中保持活性，提高連接反應(yīng)的特異性，排除了背景擴(kuò)增和免除了不斷補(bǔ)充酶的繁瑣程序。如何挑選pcr檢測(cè)試劑盒？陜西細(xì)胞pcr哪家好

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PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的多重PCR（MultiplexPCR））介紹：多重PCR可實(shí)現(xiàn)在同一反應(yīng)管中同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)不同的片段。多重PCR不僅意味著節(jié)約時(shí)間、試劑和樣本，同時(shí)使得多個(gè)擴(kuò)增子進(jìn)行同時(shí)比較成為可能。當(dāng)一個(gè)反應(yīng)管中存在多個(gè)引物對(duì)時(shí)，如在多重PCR中，非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率的降低是較關(guān)注的問(wèn)題，因?yàn)榉磻?yīng)的優(yōu)化不可能針對(duì)所有的引物對(duì)和片段。因此，引物的設(shè)計(jì)至關(guān)重要，以減少錯(cuò)配引起的非特異性擴(kuò)增。引物序列對(duì)于目標(biāo)片段應(yīng)該是獨(dú)特的，且所有引物的Tm值差異應(yīng)在5℃內(nèi)。在進(jìn)行多重PCR前，每個(gè)引物對(duì)應(yīng)在單個(gè)反應(yīng)中驗(yàn)證其特異性和擴(kuò)增效率。而且，不同大小的擴(kuò)增子應(yīng)在凝膠電泳中可區(qū)分開(kāi)，以便鑒定。除了引物設(shè)計(jì)和擴(kuò)增子大小，熱啟動(dòng)DNA聚合酶和特殊優(yōu)化的PCR緩沖液對(duì)于多重PCR也是必需的，它們可有助于擴(kuò)增的成功率和擴(kuò)增的特異性。甘肅組織pcr哪家好

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