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免疫組化的局限性，可能會(huì)有假陽性。陽性信號(hào)定位不正確即為假陽性，包括著色不勻、背景著色、邊緣效應(yīng)，另外組織的某些特定成分也能導(dǎo)致假陽性結(jié)果。假陽性可能的原因有:(1)一抗?jié)舛燃耙豢故欠袷?，抗體有一個(gè)合適的濃度范圍且必須在有效期內(nèi)使用，過期的抗體或者不著色，或者背景著色，形成假陽性;(2)試劑未充分覆蓋組織，組織邊緣的試劑易干濃度較組織中間高致深染;(3)抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)，由于室溫的影響夏季孵育時(shí)間稍短，冬季孵育時(shí)間稍長(zhǎng);(4)操作過程中組織變干，造成組織邊緣收縮或損壞形成偽影，產(chǎn)生假陽性;(5)3，3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色時(shí)間太長(zhǎng)，DAB宜現(xiàn)配現(xiàn)用，配制時(shí)間比較好在30min以內(nèi);(6)由于胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此間質(zhì)和胞漿中出現(xiàn)很多非特異性的染色，如內(nèi)源性酶血紅蛋白、肌紅蛋白等造成的著色，可以通過血清封閉解決;乳腺cancer組織中的脂肪細(xì)胞、淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生非特異性的染色;(7)非特異性抗體吸附常見于壞死組織中，使壞死組織呈較高的背景染色，在免疫組化中應(yīng)避免選擇壞死組織較多的蠟塊。英瀚斯實(shí)驗(yàn)外包，病理染色切片免疫組化，效率高！青海做得好的免疫組化推薦

實(shí)驗(yàn)失敗常見問題分析有哪些：

為什么在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陰性？

答：這種現(xiàn)象主要是由操作不當(dāng)導(dǎo)致，可能的原因有：1.染色操作不當(dāng)，致使染色失??；2.漏加一種抗體或者制備出的抗體沒有活性；3.緩沖液中有疊氮化鈉，抑制了酶的活性；4.復(fù)染或脫水劑使用不當(dāng)?shù)?。建議逐一排查，找到原因后重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)所有的切片都成陽性，這是為什么？答：與上一個(gè)問題類似，出現(xiàn)的原因也是試驗(yàn)操作存在問題，可能的原因有：1.切片在染色過程中抗體過濃，或者干片了；使用的呈色底物溶液已變色或呈色反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)；3.抗體溫育的時(shí)間過長(zhǎng)等。

在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)切片的背景很深，這是為什么？答：以下幾方面會(huì)導(dǎo)致切片的背景過深：1.蛋白質(zhì)封閉不夠或所用血清溶血，造成抗體的非特異性反應(yīng)；2.內(nèi)源性過氧化酶沒有完全阻斷，顯色過程中過氧化酶與酶底物反應(yīng)，造成背景；3.底物呈色反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)或呈色反應(yīng)后漂洗不徹底。 四川免疫組化怎么樣有沒有做免疫組化比較好的公司？

免疫組化實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)總結(jié)：

?本實(shí)驗(yàn)室所用切片一般是石蠟切片。

?烘片：使蠟片水分蒸發(fā)，石蠟軟化，組織切片牢固貼在玻片上；烘片至跟烘片前透明度有差異。

?抗原修復(fù)時(shí)，使片子始終浸沒在修復(fù)液中，液體不能干。

?一抗孵育在37度培養(yǎng)箱，濕盒放置1h，省時(shí)間和結(jié)合效果好，不要超過1h，容易過染。

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?二抗使用：兩個(gè)二抗放大信號(hào)或一個(gè)二抗；若抗體信號(hào)強(qiáng)，可不用放大信號(hào)，盡量增大信噪比。

?10XDAB在常溫溶解，盡可能現(xiàn)用現(xiàn)配，放于4度儲(chǔ)存時(shí)間久了效果不佳。

?復(fù)水和脫水時(shí)所用的梯度酒精不可混用，要區(qū)分開。

?加抗體和顯色液時(shí)，都要將片子甩干，在半干半濕的狀態(tài)下再加，不然容易造成溶液的二次稀釋。

?整個(gè)操作過程中在顯色之前，一定不能干片。

免疫組化的結(jié)果分析：

免疫組化實(shí)驗(yàn)通常需要設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照（或替代對(duì)照）（陽性對(duì)照是排除方法和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有無問題；陰性對(duì)照與替代對(duì)照是排除有無非特異性染色）。一般情況下，陽性對(duì)照顏色的特點(diǎn)為：Ag定位，包漿、胞核、胞膜、間質(zhì)具有結(jié)構(gòu)性。且染色的強(qiáng)度不同（顏色深淺不一）；陰性對(duì)照的特點(diǎn)為：染色細(xì)胞與組織無區(qū)別，顏色具有彌散性，分布均勻。

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說明：免疫組化實(shí)驗(yàn)可以對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析，但要實(shí)驗(yàn)得到的必須是高質(zhì)量的染色切片，要求背景染色淺且特異性染色較深，這樣分析的結(jié)果才會(huì)比較準(zhǔn)確。 免疫組化可以看什么？

免疫組化臨床應(yīng)用對(duì)“未分化”cancer的分類。未分化cancer包括cancer或肉瘤，在HE切片上由于cancer的“未分化”而缺少cancer細(xì)胞的起源特征不能分類，初步區(qū)分組織學(xué)類型用非特異性抗體，在其基礎(chǔ)上再選用特異性抗體做進(jìn)一步鑒定。如分化差的cancer可顯示Vimentin或S-100蛋白，有時(shí)淋巴瘤可以表達(dá)上皮膜抗原，一些黑色素瘤表現(xiàn)出角蛋白，這同時(shí)也強(qiáng)調(diào)了在cancer診斷中應(yīng)使用一組抗體而不是單個(gè)抗體。如果您有實(shí)驗(yàn)外包的需求，可以與我們南京英瀚斯生物進(jìn)行聯(lián)系，我們也有做免疫組化的服務(wù)！免疫組化如何得到好的效果？青海做得好的免疫組化推薦

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免疫組化結(jié)果背景染色較深的原因有哪些？

 （1）抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說明書進(jìn)行染色。

（2）抗體孵育時(shí)間過長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，比較好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。 

（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB比較好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊]有酶的情況下，過氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色比較好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。但是當(dāng)染**太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過長(zhǎng)。

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