江西樣本pcr實驗

PCR實驗技術(shù)中的3’RACE-PCR介紹：利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結(jié)合位點，以連有SMART寡核營酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉(zhuǎn)錄合成標(biāo)準(zhǔn)1號鏈cDNA.然后用一個基因特異引物GSP1(genespecificprimer,GSP)作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作為下游引物，以cDNA1號鏈為模板，進(jìn)行PCR循環(huán)，把目的基因3‘末端的。DNA的片段擴(kuò)增出來。

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原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為：1、固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶。2、蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。3、PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。4、雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。5、顯微鏡觀察結(jié)果。遼寧細(xì)胞pcr怎么選擇pcr檢測知識要點總結(jié)匯總。

PCR反應(yīng)的比較大特點是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人頭疼的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。主要原因有：1、標(biāo)本間交叉污染；2、PCR試劑的污染；3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染；4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染。一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。2、陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括：（1）標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。（2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測試劑是否污染。3、重復(fù)性試驗。4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

pcr防止污染的方法(一)合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進(jìn)行。(二)吸樣器:吸樣器污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入器內(nèi)或粘上器頭是一個嚴(yán)重的污染源，因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心。(三)預(yù)混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝，如有可能，PCR反應(yīng)液應(yīng)預(yù)先配制好，然后小量分裝，-20℃保存。以減少重復(fù)加樣次數(shù)，避免污染機會。另外，PCR試劑，PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。(五)設(shè)立適當(dāng)?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃詫φ找阅艹霈F(xiàn)擴(kuò)增條帶的比較低量的標(biāo)準(zhǔn)病原體核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴(kuò)增核酸的樣品作陰性對照。(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產(chǎn)物達(dá)到檢測水平就適可而止。(七)選擇質(zhì)量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進(jìn)入，打開離心管前應(yīng)先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。pcr檢測實驗有哪些分類？

PCR實驗技術(shù)中的兼并引物PCR（DegeneratePrimer）介紹：兼并引物是指代替編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強。設(shè)計引物時應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因為3'端末尾3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。因此，在引物設(shè)計時,比較選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3'端被兼并，因為3'端末尾3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR;次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。實驗證明，用脫氧肌苷引物進(jìn)行PCR,可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基。英瀚斯生物，確保pcr檢測結(jié)果真實性。遼寧熒光定量pcr

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PCR的假陽性主要原因之一引物設(shè)計不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣器內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)器頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。江西樣本pcr實驗

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