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PCR實驗技術(shù)中的Touch-downPCR介紹：Touch-downPCR又稱降落PCR.即選定一個溫度范圍，如50—35℃，每降1-2℃進(jìn)行1-2個循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個循環(huán)。Touch-down的原理隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時已經(jīng)擴(kuò)增出來，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。選擇初始復(fù)性溫度的原則起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個循環(huán)遞減1-2度Touch-downPCR的應(yīng)用范圍lowcopyoftargetedDNA;highdegreedegeneracy(orlessspecific)ofthefirstsetofprimers;推薦一些專業(yè)做pcr比較好的生物公司。遼寧pcr外包

PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。其對策有：必要時重新設(shè)計引物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。PCR的假陽性主要原因之一出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。甘肅有哪些pcr檢測做pcr檢測，每個樣本多少錢？

原位PCR就是在組織細(xì)胞里進(jìn)行PCR反應(yīng)，它結(jié)合了具有細(xì)胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術(shù)的優(yōu)點，是細(xì)胞學(xué)科研與臨床診斷領(lǐng)域里的一項有較大潛力的新技術(shù)。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標(biāo)本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細(xì)胞、血細(xì)胞等。其基本方法為：1、固定組織或細(xì)胞:將組織細(xì)胞固定于預(yù)先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細(xì)胞內(nèi)源性過氧化物酶。2、蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細(xì)胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。3、PCR擴(kuò)增:在組織細(xì)胞片上，加PCR反應(yīng)液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴(kuò)增儀的金屬板上，進(jìn)行PCR循環(huán)擴(kuò)增。有的基因擴(kuò)增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。4、雜交:PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用標(biāo)記的寡核苷酸探針進(jìn)行原位雜交。5、顯微鏡觀察結(jié)果。

PCR實驗技術(shù)中的定量PCR介紹：由于序列擴(kuò)增的產(chǎn)量依賴于模板DNA的量，所以PCR常用于對樣品中DNA進(jìn)行定量，常用的應(yīng)用是基因表達(dá)的定量。終點法PCR是一種可能的方法，但其有較大的缺點，通過凝膠電泳來檢測產(chǎn)量，檢測的靈敏度非常有限。更重要的是，使用終點PCR是在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行定量，此時擴(kuò)增已經(jīng)達(dá)到平臺期，DNA凝膠染色的強(qiáng)度與DNA起始量不成線性關(guān)系。盡管如此，通過終點法PCR可以對基因表達(dá)進(jìn)行半定量，可以使用一系列稀釋程度不同的DNA樣本作為模板起始量，或者在特定的PCR循環(huán)處獲取擴(kuò)增產(chǎn)物，然后通過凝膠顯色強(qiáng)度來估計基因的表達(dá)量。有沒有做pcr檢測比較快比較好的公司？

PCR原理:PCR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng)，基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理，以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈，單鏈DNA與人工合成的引物退火，然后耐熱DNA聚合酶以dNTP為原料使引物沿著單鏈模板延伸為雙鏈DNA。PCR全過程每一步的轉(zhuǎn)換是通過溫度的改變來控制的。需要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈、引物與模板DNA結(jié)合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高溫變性、低溫退火、中溫延伸3個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán)，此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行，就可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增。DNA模板變性：模板雙鏈DNA?單鏈DNA，94℃。退火：引物＋單鏈DNA?雜交鏈，引物的Tm值。引物的延伸：溫度至70℃左右，TaqDNA聚合酶以4種dNTP為原料，以目的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點的5’→3’DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增。pcr儀的使用說明是什么？新疆什么是pcr技術(shù)

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細(xì)胞長滿80%瓶底或皿底，換培養(yǎng)液，第二天提取RNA(倒掉培養(yǎng)液，5-10ml冰PBS洗滌細(xì)胞2次空干)加1ml冰TRizoL,用力振蕩培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落，加樣器吹打(吸入1.5ml離心管，旋渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘)加氯仿200ul,漩渦混勻器振蕩10秒，冰盒上靜置10分鐘(40C,8000rpm,5分鐘，)吸取上層水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml離心管中，加異丙醇0.5-0.7ml(充分混勻，冰盒上靜置10分鐘，40C,12000rpm,15分)棄上清,加75%冰乙醇1ml,顛倒混勻數(shù)次(40C,12000rpm,15分)棄上清,沉淀快速風(fēng)干。但不要完全干燥,加DEPC處理去離子水50-100ul取5ul作RNA電泳，5ul作RNA定量，余-800C冰箱保存遼寧pcr外包

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