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PCR實驗技術中的高GC含量PCR（GC-richPCR）介紹：具有高GC含量（>65%）的模板由于G和C堿基間的強氫鍵影響，比較難以擴增。高GC含量序列同時也涉及二級結構。因此，高GC含量序列可使DNA聚合酶在擴增時卡住，從而影響了DNA的合成。為了擴增高GC含量片段，雙鏈模板必須分離，以便引物結合及DNA聚合酶讀取序列。為了克服強GC相互作用，較常用的方法是依靠PCR添加劑或共溶劑來幫助DNA變性（圖6A），如DMSO。這些試劑通常會降低引物的Tm，所以退火溫度也需做相應的調整。高合成能力的DNA聚合酶由于其與模板的強結合能力，有助于高GC含量模板的PCR擴增（圖6B）。高熱穩(wěn)定性DNA聚合酶也有益于高GC含量PCR擴增，因為更高的變性溫度（如98℃代替95℃）可促進解鏈和PCR擴增。pcr檢測實驗有哪些分類？安徽推薦pcr原理

PCR實驗技術中的5’RACE-PCR介紹：利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以Oligo(dT)30MN作為鎖定引物在反轉錄酶MMLV作用下，反轉錄合成標準一號鏈cDNA.利用該反轉錄酶具有的末端轉移酶活性，在反轉錄達到一號鏈的5‘末端時自動加上3一5個(dC)殘基，退火后(dC)殘基與含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接頭引物配對后，轉換為以SMART序列為模板繼續(xù)延伸而連上通用接頭(figure2)。然后用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universalprimer,UPM)作為上游引物，用一個基因特異引物2(GSP2genespecificprimer,GSP)作為下游引物，以SMART一號鏈cDNA為模板，進行PCR循環(huán)，把目的基因5‘末端的cDNA的片段擴增出來。比較終，從2個有相互重疊序列的3'/5‘-RACE產物中獲得全長cDNA，或者通過分析RACE產物的3‘和5‘端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA.四川推薦pcr怎么樣簡述熒光定量pcr的基本原理。

PCR實驗技術中cDNA第二鏈的合成方法有以下幾種:1、自身引導法合成的單鏈cDNA3'端能夠形成一短的發(fā)夾結構，這就為第二鏈的合成提供了現(xiàn)成的引物，當***鏈合成反應產物的DNA:RNA雜交鏈變性后利用大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段或反轉錄酶合成cDNA第二鏈，***用對單鏈特異性的S1核酸酶消化該環(huán)，即可進一步克隆。但自身引導合成法較難控制反應，而且用S1核酸酶切割發(fā)夾結構時無一例外地將導致對應于mRNA5'端序列出現(xiàn)缺失和重排，因而該方法目前很少使用。2、置換合成法該方法利用鏈在反轉錄酶作用下產生的cDNA:mRNA雜交鏈不用堿變性，而是在dNTP存在下，利用RNA酶H在雜交鏈的mRNA鏈上造成切口和缺口。從而產生一系列RNA引物，使之成為合成第二鏈的引物，在大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的作用下合成第二鏈。該反應有3個主要優(yōu)點:(1)非常有效；(2)直接利用鏈反應產物，無須進一步處理和純化；(3)不必使用S1核酸酶來切割雙鏈cDNA中的單鏈發(fā)夾環(huán)。

PCR實驗技術中的定量PCR介紹：由于序列擴增的產量依賴于模板DNA的量，所以PCR常用于對樣品中DNA進行定量，常用的應用是基因表達的定量。終點法PCR是一種可能的方法，但其有較大的缺點，通過凝膠電泳來檢測產量，檢測的靈敏度非常有限。更重要的是，使用終點PCR是在PCR反應結束后進行定量，此時擴增已經達到平臺期，DNA凝膠染色的強度與DNA起始量不成線性關系。盡管如此，通過終點法PCR可以對基因表達進行半定量，可以使用一系列稀釋程度不同的DNA樣本作為模板起始量，或者在特定的PCR循環(huán)處獲取擴增產物，然后通過凝膠顯色強度來估計基因的表達量。熒光定量pcr和實時定量pcr的區(qū)別？

PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備。

2、模板DNA與引物的退火（復性）：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合。3、引物的延伸：DNA模板--引物結合物在72℃、DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈。重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 英瀚斯生物pcr檢測，保證真實實驗檢測，數(shù)據保密完整性。黑龍江有哪些pcr原理

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原位PCR就是在組織細胞里進行PCR反應，它結合了具有細胞定位能力的原位雜交和高度特異敏感的PCR技術的優(yōu)點，是細胞學科研與臨床診斷領域里的一項有較大潛力的新技術。原位PCR是Hasse等于1990年建立的，實驗用的標本是新鮮組織、石蠟包埋組織、脫落細胞、血細胞等。其基本方法為：1、固定組織或細胞:將組織細胞固定于預先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛處理，再滅活除去細胞內源性過氧化物酶。2、蛋白酶K消化處理:用60ug/ml的蛋白酶K將固定好的組織細胞片55℃消化處理2h后，96℃2min以滅活蛋白酶K。3、PCR擴增:在組織細胞片上，加PCR反應液，覆蓋并加液體石蠟后，直接放在擴增儀的金屬板上，進行PCR循環(huán)擴增。有的基因擴增儀帶有專門用于原位PCR的裝置。4、雜交:PCR擴增結束后，用標記的寡核苷酸探針進行原位雜交。5、顯微鏡觀察結果。安徽推薦pcr原理

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