BAX免疫熒光分析

來源: 發(fā)布時(shí)間:2023-09-22

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。BAX免疫熒光分析

BAX免疫熒光分析,免疫

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):非特異性染色:是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶;孵育過程中干片;抗原熱修復(fù)過度。染色過深:一抗?jié)舛冗^高;染色試濃度過高或孵育時(shí)間過長;染色劑濃度過高或孵育時(shí)間過長。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,但若檢測抗原是水不溶性蛋白,可先通透再固定,這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號;建議設(shè)陰性對照組,消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色;選擇醛類固定液時(shí),保持其新鮮度,較好現(xiàn)配現(xiàn)用,使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高。ki67免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

BAX免疫熒光分析,免疫

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法:直接法和間接法。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,經(jīng)過一定時(shí)間反應(yīng),即可結(jié)合并顯色。間接法:先用抗原的抗體(一抗)與抗原反應(yīng)結(jié)合,再用熒光標(biāo)記的二抗(一抗的抗體)與抗原反應(yīng),形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物。

免疫熒光的原理:免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。

BAX免疫熒光分析,免疫

熒光的猝滅:熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會減弱甚至猝滅,這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光(特別是紫外光)的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán)、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染,以減弱非特異性熒光本質(zhì),使特異熒光更突出顯示。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。ki67免疫熒光染色

免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù),用于檢測和定位特定抗原或抗體。BAX免疫熒光分析

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢:定量熒光信號的能力(與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反);復(fù)用能力(可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì));熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,以及利用定量技術(shù)測定含量。BAX免疫熒光分析