江蘇cck8 吸光度

制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1.先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2.按比例(例如：1/2比例)依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度，一般要做3-5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，每組3-6個(gè)復(fù)孔。3.接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測(cè)定O.D值，制作出一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo)(X軸)，O.D值為縱坐標(biāo)(Y軸)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以測(cè)定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量(使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間)。***篩選：在測(cè)定一個(gè)***的毒性和安全有效濃度時(shí)，經(jīng)常會(huì)用到CCK-8。江蘇cck8 吸光度

CCK8，即Cell Counting Kit-8，與MTT法的主要區(qū)別如下：一、原理不同1、Cell Counting Kit-8：CCK-8 試劑盒利用了日本同仁化學(xué)研究所（Dojindo）開發(fā)的四唑鹽WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)。2、MTT法：其檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。浙江cck8檢測(cè)計(jì)算微生物對(duì)細(xì)胞的毒性或增殖的實(shí)驗(yàn)。

CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖/毒性的方法：

1.將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胰酶消化后，完全培養(yǎng)基重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。

2.根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)快慢決定鋪板細(xì)胞密度（多數(shù)為1000-2000 cell/well），每組3-5重復(fù)，每孔100-200μl培養(yǎng)基。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)決定鋪板數(shù)量（如需要檢測(cè)5天，則鋪5張96孔板），我們以1000 cell/well，5復(fù)孔，200μl培養(yǎng)基，檢測(cè)5天為例，各實(shí)驗(yàn)組需要細(xì)胞數(shù)量為1000×5×5個(gè)細(xì)胞，從計(jì)數(shù)好的細(xì)胞懸液中取出所需的細(xì)胞量和完全培養(yǎng)基混勻，**終體積為200×5×5μl。

細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)1.在96孔板中配制100ml的細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)(在37℃，5%CO2的條件下)。2.向培養(yǎng)板加入10ml不同濃度的待測(cè)物質(zhì)。3.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(例如:6,12,24或48小時(shí))。4.向每孔加入10mlCCK-8溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù))。5.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。6.用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。7.如果暫時(shí)不測(cè)定O.D值，打算以后測(cè)定的話，可以向每孔中加入10ml0.1MHCl溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉***的影響。當(dāng)然***影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。換液的意思是將cck8加在培養(yǎng)基中以換液的形式加在孔板中避免氣泡產(chǎn)生。

CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請(qǐng)見說(shuō)明書）：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞活性檢測(cè)1、在96孔板中接種細(xì)胞懸液（100μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)（37℃,5%CO2）。2、向每孔加入10μLCCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響OD值的讀數(shù)）。3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。4、用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。5、若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。請(qǐng)問合適的種板數(shù)是怎么定義的呢?北京cck8每次數(shù)據(jù)都不一樣

若細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8.江蘇cck8 吸光度

五、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：·若暫時(shí)不測(cè)定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時(shí)內(nèi)測(cè)定，吸光度不會(huì)發(fā)生變化。·如果待測(cè)物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可。·當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的**小接種量至少為1,000個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測(cè)白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔(100μl培養(yǎng)基)。江蘇cck8 吸光度