杭州重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項：1.細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。因轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞有毒害作用，細(xì)胞太少，容易死。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2-4×106細(xì)胞/ml，確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。細(xì)胞的融合度必須要達(dá)到90%才能做啟動子的選擇獲得高轉(zhuǎn)染活性所需選擇的啟動子依賴于選用的細(xì)胞系和要表達(dá)的蛋白。CMV啟動子在大多數(shù)細(xì)胞類型中可以獲得高表達(dá)活性。同其他啟動子，如SV40和RSV(勞斯肉瘤細(xì)菌)相比，在BHK-21中其活性較高。這三種細(xì)菌啟動子在T細(xì)胞來源的細(xì)胞系，如Jurkat中組成表達(dá)水平較低。轉(zhuǎn)染后在培養(yǎng)基中加入PHA-L和PMA可以啟動Jurkat細(xì)胞中CMV啟動子，而單PMA就足以啟動KG1和K562(人骨髓瘤白細(xì)胞)中的CMV啟動子。來指示細(xì)胞中目標(biāo)基因是否存在，這樣的報告基因一般可以在轉(zhuǎn)染后一兩天內(nèi)檢測到。杭州重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的常用方法：磷酸鈣共沉淀原理：該法可用于瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。然而因其對pH、溫度和緩沖液鹽濃度的微小變化十分敏感，所得結(jié)果容易出現(xiàn)差異，且對許多類型的細(xì)胞培養(yǎng)物(尤其是原代細(xì)胞)具有細(xì)胞毒性，轉(zhuǎn)染效率較差。實驗步驟：將核酸與氯化鈣在磷酸鹽緩沖液中混合，同時控制好pH、溫度等條件→室溫孵育，生成濃縮DNA的極小不溶性顆粒沉淀→將顆粒型沉淀分散到細(xì)胞中，促進(jìn)DNA粘附在細(xì)胞表面→共沉淀通過內(nèi)吞作用進(jìn)入胞漿→分析細(xì)胞瞬時基因表達(dá)或者選擇穩(wěn)定性傳染。廈門正規(guī)細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑單價到時后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液。

轉(zhuǎn)染效率：線型PEI(LinePEI,LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(BranchedPEI,BPEI)要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但較近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時細(xì)胞毒性也增大。超很高枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實驗中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。GenEscort是采用各種分枝狀和超很高枝狀的小分子PEI與各種含有生理條件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列很高枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理條件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的注意事項：物品(PS)物品，比如青霉素和鏈霉素，是影響轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基添加物。這些物品一般對于真核細(xì)胞無毒，但陽離子脂質(zhì)體試劑增加了細(xì)胞的通透性，使物品可以進(jìn)入細(xì)胞。這降低了細(xì)胞的活性，導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低。所以，在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中不能使用物品，甚至在準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染前進(jìn)行細(xì)胞鋪板時也要避免使用物品。這樣，在轉(zhuǎn)染前也不必潤洗細(xì)胞。對于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不要在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，ICIN選擇性物品的競爭性克制劑。另外，為了保證無血清培養(yǎng)基中細(xì)胞的健康生長，使用比含血清培養(yǎng)基更少的物品量操作簡便，對細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染為什么不能加血清：傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)染試劑一般會增加細(xì)胞的通透性，這樣會把血清中的成分帶入細(xì)胞，造成細(xì)胞毒性。陽離子脂質(zhì)體，轉(zhuǎn)染的過程是帶正電的脂質(zhì)體與核酸帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)形成復(fù)合物被細(xì)胞內(nèi)吞。血清中含有大量的蛋白質(zhì)，在轉(zhuǎn)染過程中，帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可能干擾陽離子脂質(zhì)體對核酸的吸附，影響轉(zhuǎn)染效率。同時，也會將血清中的蛋白帶入細(xì)胞，引發(fā)細(xì)胞毒性，故不能有血清轉(zhuǎn)染。這些轉(zhuǎn)染試劑要求在轉(zhuǎn)染前換無血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后4-6h在更換成有血清培養(yǎng)基，這其實是為了減輕轉(zhuǎn)染造成的細(xì)胞毒性和轉(zhuǎn)染效率的降低。在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學(xué)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，則各有其特點。北京細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑價格

細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。杭州重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑

轉(zhuǎn)染的注意事項：細(xì)胞鋪板密度用于轉(zhuǎn)染的較佳細(xì)胞密度根據(jù)不同的細(xì)胞類型或應(yīng)用而異。一般轉(zhuǎn)染時，貼壁細(xì)胞密度為70%-90%，懸浮細(xì)胞密度為2×106-4×106細(xì)胞/ml時效果較好。確保轉(zhuǎn)染時細(xì)胞沒有長滿或處于靜止期。因為轉(zhuǎn)染效率對細(xì)胞密度很敏感，所以在不同實驗間保持一個基本的傳代步驟很重要。鋪板細(xì)胞數(shù)目的增加可以增加轉(zhuǎn)染活性和細(xì)胞產(chǎn)量。在三種不同密度進(jìn)行細(xì)胞鋪板的比較表明鋪板密度較高的，CAT活性也較高。得到較高活性所需的LIPOFECTAMINE試劑的量也相應(yīng)增加了。這些結(jié)果說明，對于轉(zhuǎn)染相同量的DNA所需的較佳陽離子脂質(zhì)體試劑的量會因細(xì)胞密度而異杭州重慶細(xì)胞高效轉(zhuǎn)染試劑