40KPEI轉(zhuǎn)染試劑蛋白產(chǎn)量

化學(xué)轉(zhuǎn)染方法是生物醫(yī)學(xué)研究中常用的轉(zhuǎn)染方法，主要包括兩類(lèi)：陽(yáng)離子脂質(zhì)體和陽(yáng)離子聚合物。其基本原理是利用陽(yáng)離子的化學(xué)分子與帶有負(fù)電荷的核酸通過(guò)正負(fù)電荷作用形成穩(wěn)定的復(fù)合物。一方面使復(fù)合體整體帶上正電荷（多數(shù)細(xì)胞膜表面帶有弱的負(fù)電荷，通過(guò)電荷作用吸引復(fù)合體到細(xì)胞膜表面）；另一方面對(duì)線(xiàn)性的核酸進(jìn)行濃縮，使其體積變小更易穿透細(xì)胞膜。陽(yáng)離子聚合物類(lèi)轉(zhuǎn)染試劑可以說(shuō)是貧窮實(shí)驗(yàn)室的福音了。早在2012年就有研究小組在大名鼎鼎的Nature Protocol上發(fā)表了PEI作為轉(zhuǎn)染試劑的詳細(xì)方法，到現(xiàn)在被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室采用。PEI轉(zhuǎn)染對(duì)復(fù)合物孵化的時(shí)間是有要求的，一般建議5~20分鐘之間。40KPEI轉(zhuǎn)染試劑蛋白產(chǎn)量

準(zhǔn)備DNA-PEI復(fù)合物：DNA、PEI試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)表1所示，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他適合的無(wú)蛋白培養(yǎng)基稀釋適量DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋PEI試劑。每1μgDNA需用2-5μL線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有DNA溶液的試管，一邊將稀釋的線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請(qǐng)勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置10~25min以形成DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時(shí)，請(qǐng)用圓底聚丙烯管，例如Falcon5mL/14mL離心管。3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：直接向每個(gè)孔中加入DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染時(shí)，去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換成無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染3h后，添加?體積的包含30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。4.孵育細(xì)胞和分析結(jié)果：在CO2培養(yǎng)箱中37℃下孵育細(xì)胞至可以分析檢測(cè)。轉(zhuǎn)染后快7h即可檢測(cè)到轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)。5.轉(zhuǎn)染24h后，將細(xì)胞傳代至新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中（將細(xì)胞稀釋10倍以上），在CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育過(guò)一晚。第二天加入與轉(zhuǎn)染抗性基因相匹配的篩選藥物。約1~2周可篩選到耐藥性克隆，在這期間需經(jīng)常更換含篩選藥物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。速溶型PEI轉(zhuǎn)染試劑優(yōu)化要素為什么PEI轉(zhuǎn)染試劑配制的過(guò)程中要加酸？

特別提醒1.對(duì)于某些類(lèi)型的細(xì)胞如HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前兩天鋪板可顯著提高轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)水平。如果選擇轉(zhuǎn)染前兩天鋪板，可適當(dāng)降低鋪板密度，以確保轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞的匯合度仍為70~80%。2.對(duì)于接觸抑制敏感的細(xì)胞，可適當(dāng)降低鋪板密度。3.即使在有蛋白（如10%的血清）存在的情況下，DNA-PEI復(fù)合物仍能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但是DNA-PEI復(fù)合物必須在無(wú)蛋白存在的條件下形成。我們推薦使用Opti-MEMITM培養(yǎng)基以達(dá)到*轉(zhuǎn)染效率。其他的無(wú)蛋白培養(yǎng)基則需測(cè)試與線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑的兼容性。4.對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)而言，每1μgDNA使用3.0μLEndoFectinTM試劑都能獲得較高轉(zhuǎn)染效率。使用者也可嘗試每1μgDNA使用1~4μL體積線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行優(yōu)化。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法：1.接種細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一晚，用膠原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，每個(gè)孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70~80%。2.準(zhǔn)備DNA-PEI復(fù)合物：DNA、PEI試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。依據(jù)表1所示，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他適合的無(wú)蛋白培養(yǎng)基稀釋適量DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋PEI試劑。每1μgDNA需用1.5-5μL線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑(這個(gè)需要客戶(hù)自行摸索配比，每一批轉(zhuǎn)染試劑和每一批DNA比例可能會(huì)稍有不同）。一邊輕輕渦旋裝有DNA溶液的試管，一邊將稀釋的線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請(qǐng)勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置10~25min以形成DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時(shí)，請(qǐng)用圓底聚丙烯管，例如NEST5mL/14mL離心管。3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：直接向每個(gè)孔中加入DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染時(shí)，去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換成無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染1.5h后，添加?體積的包含30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。PEI轉(zhuǎn)染試劑的穩(wěn)定性如何？

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法1.接種細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一晚，用膠原酶（WORTHINGTONG公司LS004196)消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)（不建議用胰酶）。調(diào)整細(xì)胞濃度，將細(xì)胞鋪入細(xì)胞培養(yǎng)的器皿，每個(gè)孔置入的細(xì)胞量應(yīng)能使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到70~80%。2.準(zhǔn)備DNA-PEI復(fù)合物：DNA、PEI試劑和稀釋劑在進(jìn)行以下步驟前需先使其升至室溫。，用Opti-MEMITM（Invitrogen）或其他適合的無(wú)蛋白培養(yǎng)基稀釋適量DNA。用同樣的培養(yǎng)基稀釋PEI試劑。每1μgDNA需用1.5-5μL線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑。一邊輕輕渦旋裝有DNA溶液的試管，一邊將稀釋的線(xiàn)性PEI轉(zhuǎn)染試劑滴加至試管中（注意：請(qǐng)勿顛倒添加順序）。充分混勻后，室溫靜置10~25min以形成DNA-PEI復(fù)合物。當(dāng)溶液體積較大時(shí)，請(qǐng)用圓底聚丙烯管，例如NEST5mL/14mL離心管。3.轉(zhuǎn)染細(xì)胞：直接向每個(gè)孔中加入DNA-PEI復(fù)合物并輕輕渦旋培養(yǎng)板/培養(yǎng)皿。在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染時(shí)，去除生長(zhǎng)培養(yǎng)基，替換成無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴DNA-PEI復(fù)合物。轉(zhuǎn)染1.5h后，添加?體積的包含30%血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基PEI轉(zhuǎn)染試劑的殘留檢測(cè)方法怎么開(kāi)發(fā)？進(jìn)口PEI轉(zhuǎn)染試劑殘留檢測(cè)方法

如何優(yōu)化PEI轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染時(shí)的比例？40KPEI轉(zhuǎn)染試劑蛋白產(chǎn)量

方法：1．細(xì)胞分盤(pán)：通過(guò)胰酶消化收集細(xì)胞，用適當(dāng)?shù)耐耆囵B(yǎng)基以4×105至8×105細(xì)胞/cm2的密度平鋪細(xì)胞于60mm組織培養(yǎng)皿上（根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要選擇培養(yǎng)皿，使細(xì)胞貼壁后所占總面積達(dá)到培養(yǎng)皿面積的70-90％）。根據(jù)細(xì)胞貼壁情況于含5％CO2的37℃溫箱中孵育8-24h,當(dāng)細(xì)胞貼壁完全后即可開(kāi)始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前換入2mL預(yù)熱的無(wú)血清培養(yǎng)基。2.制備PEI-DNA混合物：以60mm組織培養(yǎng)皿用420μL反應(yīng)總體積為例。準(zhǔn)備兩支1.5mL離心管，一管將質(zhì)粒DNA（總量2-8μg為佳）加入240μLHBS中，混勻。另一管中則用HBS將100μM的PEI儲(chǔ)存液稀釋成10μM，充分混合。然后取180μL10μMPEI溶液加入含有DNA的HBS中，充分混勻后室溫靜置20-30min。將這420μL的PEI-DNA混合液逐滴加入上述單層細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕搖動(dòng)平皿混勻，置于含5％～7％CO2的37℃溫箱孵育。注：每次用100μM的PEI儲(chǔ)存液前都需要先將其充分混勻，保證所取的濃度一致。3.培養(yǎng)6-10h后更換為37℃預(yù)熱的含有血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，16h左右可以觀測(cè)到報(bào)告基因的表達(dá)。40KPEI轉(zhuǎn)染試劑蛋白產(chǎn)量

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