北京GlySERIASIdeS蛋白酶

對(duì)于攜帶突變鉸鏈的 Fc 融合蛋白或抗體來說，F(xiàn)ab 和 Fc 片段的生成可能具有挑戰(zhàn)性。Genovis的GingisKHAN酶在鉸鏈上方一個(gè)可觸及的賴氨酸位點(diǎn)消化人IgG1，在足夠溫和的還原條件下保留鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵，從而產(chǎn)生完整的Fab和Fc片段。對(duì)于融合蛋白，消化通常在鉸鏈上方獲得，但融合伴侶的結(jié)構(gòu)和氨基酸序列可能導(dǎo)致其他暴露的消化位點(diǎn)。如果去除保守的 Fc N-聚糖，F(xiàn)c 中的第二個(gè)切割位點(diǎn)也可能被GingisKHAN酶切。將精選的單克隆人 IgG1 抗體和 Fc 融合蛋白與 GingisKHAN 在 37°C 下孵育 1 小時(shí)，并通過 HPLC 進(jìn)行分析。如FabRICATOR Immobilized，可快速輕松地生成均質(zhì) F（ab'）2 和 Fc/2 片段。北京GlySERIASIdeS蛋白酶

Genovis的FabRICATOR MagIC自動(dòng)樣品制備可用于分析和監(jiān)測(cè)不同的CQA。mAb在生產(chǎn)或儲(chǔ)存過程中的氧化就是這樣一種CQA，可能會(huì)影響zhiliao產(chǎn)品的質(zhì)量。為了展示FabRICATOR MagIC如何解決這個(gè)問題，對(duì)6種mAb的混合物進(jìn)行強(qiáng)制降解（室溫下3個(gè)月），并通過反相LC-MS進(jìn)行分析。當(dāng)在完整水平上分析mAb時(shí)，可以檢測(cè)到mAb5豐度的顯著差異，同時(shí)出現(xiàn)許多新的峰。然而，無法獲得可靠的質(zhì)量數(shù)據(jù)。使用FabRICATOR MagIC，mAb5變化的來源在Fab區(qū)域內(nèi)。隨后還原為 Fc/2、LC 和 Fd' 片段，可以識(shí)別差異是由于 mAb5 Fd' 片段上的色氨酸氧化，通過形成氧代內(nèi)酯 （+14 Da） 和二氧代內(nèi)酯 （+30 Da） 以及 mAb5 LC （-18 Da） 的琥珀酰亞胺化來揭示。此外，還可檢測(cè)到mAb3輕鏈的異構(gòu)化。該示例說明了FabRICATOR MagIC在mAb中級(jí)分析中的強(qiáng)大功能，它創(chuàng)建的片段足夠小，可以精確定位特定的修飾，而無需耗時(shí)耗費(fèi)資源的肽圖分析，所有這些都以相對(duì)較少的手動(dòng)操作時(shí)間快速完成。黑龍江FabDELLOIdeS蛋白酶FabRICATOR（IdeS）不需要還原條件來獲得比較好的活性。

Genovis除了提供IdeS酶以外，還提供很多種特異性蛋白酶，如半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE）。IgdE 在鉸鏈正上方的一個(gè)特定位點(diǎn)消化人 IgG1，產(chǎn)生完整的 Fab 和 Fc 片段的均質(zhì)池。它在pH值和鹽濃度范圍內(nèi)具有活性，不需要任何還原劑或輔助因子。因此，與許多其他常用的蛋白酶相比，F(xiàn)abALACTICA不需要任何優(yōu)化來避免過度消化。這使得FabALACTICA成為一種有吸引力的酶，例如在還原和非還原條件下的LC-MS分析、抗體高階結(jié)構(gòu)（HOS）的結(jié)晶和NMR研究、雙特異性或多特異性抗體的表征、單價(jià)結(jié)合研究和完整的Fc聚糖分析。

IgA 消化酶的 IgASAP 家族特異性消化血清和分泌型人 IgA 以生成 Fab 和 Fc 片段。IgASAP Sub1 特異性消化人 IgA1，而 IgASAP Sub1+2 同時(shí)消化人 IgA1 和 IgA2m1。 Sub1+2 特異性消化鉸鏈上方的 IgA1 和 IgA2m1。兩種酶都產(chǎn)生完整且均質(zhì)的 Fab 和 Fc 片段。為了獲得純和完整的Fab片段，使用Genovis的GingisKHAN Fab Kit進(jìn)行人IgG1的消化和抗體片段的后續(xù)純化。通過與 GingisKHAN 孵育，然后在 CaptureSelect? 人 CH1 離心柱上親和純化，在曲妥珠單抗上證明了完整的片段生成。樣品的酶和Fc部分存在于色譜柱的流通中，F(xiàn)ab很容易通過降低pH洗脫。使用該試劑盒，可以制備 0.5 mg 至 2 mg 人 IgG1 的 Fab 片段。Genovis同時(shí)提供IdeS酶的純化試劑盒。Genovis的FabULOUS （SpeB）制備的Fab片段可用于親和力研究、Fab糖基化研究和結(jié)構(gòu)研究。

為了讓所有實(shí)驗(yàn)室都能同時(shí)快速自動(dòng)消化多種抗體，Genovis的FabRICATORMagIC的設(shè)計(jì)具有靈活性，適用于一系列自動(dòng)化平臺(tái)。我們?cè)赥hermoScientific?KingFisher?純化系統(tǒng)上優(yōu)化了FabRICATORMagIC的工作流程，但它可以轉(zhuǎn)移到其他自動(dòng)化平臺(tái)，如果沒有自動(dòng)化，在振動(dòng)臺(tái)上也能同樣出色地工作。消解后，將含有處理樣品的深孔板直接轉(zhuǎn)移到LC-MS的自動(dòng)進(jìn)樣器中進(jìn)行快速色譜分析，或轉(zhuǎn)移到其他分析方法進(jìn)行分析。FabRICATORMagIC與在消解緩沖液中添加0.05%聚山梨醇酯20兼容，以極大限度地減少自動(dòng)化系統(tǒng)中可能發(fā)生的純粹壓力。使用KingFisher儀器處理樣品時(shí)，樣品制備非常簡(jiǎn)單。將樣品、樹脂和緩沖液移液到指定的孔或板中，然后將板放入儀器中。設(shè)計(jì)用于FabRICATORMagIC的BindIt?協(xié)議將控制每個(gè)步驟的孵育溫度和時(shí)間。但要在親和步驟中捕獲 Fc 片段，您需要另一種填料。黑龍江GlycINATORIdeS蛋白酶蛋白組學(xué)

自動(dòng)抗體亞基分析可減少操作人員的時(shí)間和樣品處理錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn)，并提高通量。北京GlySERIASIdeS蛋白酶

Genovis的半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE）與IdeS酶一樣是特異性蛋白酶。在二維核磁共振波譜 （2D-NMR） 之后，可以通過 HOS 分析在精確的原子水平上評(píng)估 mAb 的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。從Genovis的FabALACTICA Immobilized獲得均相Fab和Fc片段的工作流程，是評(píng)估嵌合單克隆抗體英夫利昔單抗中HOS的理想選擇，在海報(bào)“FabALACTICA產(chǎn)生純和均相的mAb亞基，促進(jìn)2D-NMR波譜分析”中進(jìn)行了描述。來自生成的 Fab 和 Fc 片段的高質(zhì)量信號(hào)和光譜分辨率導(dǎo)致能夠觀察 Fab 和 Fc 之間的結(jié)構(gòu)變化、氧化和非氧化樣品之間的差異，并通過觀察原子分辨率來比較原研劑和生物仿制藥的 HOS。北京GlySERIASIdeS蛋白酶