四川PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學研究

經(jīng)過多年的經(jīng)驗積累及市場積淀，倍篤生物已組合多條不同產(chǎn)品線，分別滿足體外診斷、organoid及干細胞、細胞基因藥物等領域的需求。其中，細胞基因藥物領域產(chǎn)品線包含SAN HQ高鹽核酸酶及M-SAN HQ中鹽核酸酶、泊洛沙姆P 188 Bio、GMP級MSC/PSC培養(yǎng)基、GMP級膠原酶、AAV滴度檢測產(chǎn)品、工藝雜質(zhì)及外源污染物殘留檢測產(chǎn)品、聚糖分析用酶、ADC偶聯(lián)技術、QED抗體對、AAV中和抗體、蛋白酶等；相關品牌有挪威ArcticZymes Technologies、德國BASF、德國Sartorius、德國Nordmark、瑞典Genovis、美國QED、中國君研生物等。OpeRATOR 是一種 O-聚糖特異性蛋白酶，可消化攜帶he心 1 O-聚糖的蛋白質(zhì)，糖基化（he心 1）Ser 和 Thr 殘基的 N 端。四川PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學研究

為了研究 OglyZOR 對天然糖蛋白的活性，將該酶與依那西普、TNFR 和阿巴西普在 37°C 下有或沒有 SialEXO 孵育 1 小時。當唾液酸被去除時，OglyZOR酶有效地水解了所有三種底物中的O-聚糖。Genovis的OglyZOR 酶可有效水解天然糖蛋白中的he心 1 二糖 （Gal-β1,3-GalNAc）。這使得這些酶適合在LC-MS分析之前制備樣品，以鑒定其他PTM或確認氨基酸序列O-糖基化生物制藥的全去糖基化：O-糖基化生物制藥（如依那西普）很難表征。為了能夠通過質(zhì)譜法測定完整質(zhì)量數(shù)，我們進行了酶促總去糖基化。N-聚糖被Genovis的PNGase F裂解，而O-聚糖可以與OglyZOR和SialEXO一起去除。。河南用于自動化系統(tǒng)的96孔板形式PNGaseF去糖基化酶疾病機理研究ImpaRATOR? 可用于多種 O-聚糖結構表征。

Fc N-聚糖在抗體的效應功能中起著至關重要的作用，但可能會增加蛋白質(zhì)表征測定的復雜性。在天然條件下用PNGase F去除Fc N-糖可以表征游離N-糖以及去糖基化抗體的功能和結構。 為了證明PNGase F固定化和PNGase F凍干在天然反應條件下有效去除Fc N-聚糖，對zhiliao性抗體曲妥珠單抗進行了處理。圖2中的質(zhì)量數(shù)偏移表明，在37°C下用Genovis的PNGase F凍干或PNGase F固定化孵育1小時后，曲妥珠單抗上的Fc N-聚糖成功去除，與在溶液中用PNGase F凍干處理的樣品相比，沒有酶干擾用PNGase F固定處理的樣品的分析。

Genovis的PNGase F 是一種糖酰胺酶，可水解多肽天冬酰胺與所有哺乳動物天冬酰胺連接復合物、雜交體或高甘露糖寡糖的內(nèi)層 GlcNAc 之間的酰胺鍵。 在反應過程中，從中去除聚糖的天冬酰胺殘基被脫酰胺為天冬氨酸。釋放的低聚糖完好無損，可用于進一步分析。N-糖的去除被用于MS分析的樣品制備，以降低蛋白質(zhì)的異質(zhì)性，使游離的糖分析成為可能，并研究N-糖的功能作用。 該酶在大腸桿菌中表達，該重組基因來源于伊麗莎白金氏腦膜敗血癥。 評價抗體片段對完整蛋白聚集的影響。 IgG1 mAb1和mAb2在Biogen生產(chǎn)。 mAb1被糖基化，主要的糖型是具有0和1半乳糖的he心聚焦雙觸角聚糖(FA2和FA2G1); mAb2被糖基化。PNGase F是一種非常成熟的工具。O-糖的去除可能更具挑戰(zhàn)性，現(xiàn)有的O-糖釋放化學方法不太適合下游分析。

Genovis的SialEXO固定化用于復雜糖蛋白的去唾液酸化：在設置反應條件時，需要在所需的反應時間和完成反應所需的酶量之間進行權衡。較高的酶量可保證在更短的時間內(nèi)完成周轉，但會使下游分析復雜化。為了避免此類問題，我們以離心柱形式固定了活性SialEXO。這允許以更短的孵育時間孵育具有明顯更高量的唾液酸酶的糖蛋白底物。Genovis測試了 SialEXO 凍干和 SialEXO 固定化在人 C1 抑制劑上的性能。這種糖蛋白是一種具有挑戰(zhàn)性的底物，具有 6 個 N- 和多達 26 個 O-聚糖，由 α2,3 和 α2,6 連接的唾液酸修飾。對游離的N-聚糖的分析表明，SialEXO在溶液中完全脫唾液酸化，SialEXO固定化。使用 GalNAcEXO 對 O-糖基化生物制藥進行 Tn 抗原表征。黑龍江瑞典GenovisPNGaseF去糖基化酶糖生物學研究

唾液酸的去除有助于研究蛋白質(zhì)中的潛在變體。SialEXO酶可在電荷異構體分析之前去除所有唾液酸。四川PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學研究

在這里，Genovis分析了 C1 抑制劑——一種人血漿衍生的生物zhiliao藥物，由 6 種 N-聚糖和多達 28 種 O-聚糖修飾，主要由唾液酸he心 1 結構組成。在不對這種高度異質(zhì)的蛋白質(zhì)進行任何預處理的情況下，反相LC-MS分析產(chǎn)生了無法詳細解釋的復雜質(zhì)譜圖。在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時內(nèi)有效去除所有O-聚糖。然而，蛋白質(zhì)上仍殘留著 1 到 3 個 N-聚糖。使用凍干的PNGase F和OmniGLYZOR試劑盒中包含的MS友好型RapiGest? SF表面活性劑*，在變性條件下通過額外的去糖基化步驟去除這些不可接近的N-聚糖。觀察到所有聚糖的完全去除，但分子上存在的少量he心 2 O-聚糖除外。水解O-聚糖的酶不會從變性中獲益，這就是為什么OmniGLYZOR Microspin色譜柱只能在非變性條件下使用的原因。四川PNGaseF去糖基化酶蛋白質(zhì)組學研究