無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染：PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但令人腦袋不適的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。 污染原因：標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。熱啟動(dòng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：一種在PCR的初始建立階段減少非特異性擴(kuò)增的技術(shù)。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

基于聚合酶鏈反應(yīng)的遺傳(或脫氧核糖核酸)指紋圖譜協(xié)議的發(fā)展已在法醫(yī)學(xué)中得到較廣應(yīng)用：遺傳指紋以其辨別力的形式，可以從世界上所有人群中獨(dú)特地區(qū)分任何一個(gè)人。微小的DNA樣本可以從犯罪現(xiàn)場，和比較的從嫌疑人那里，或者從DNA資料庫早期的證據(jù)或罪犯。這些測試的簡單版本通常用于在刑事調(diào)查中快速排除嫌疑人。幾十年前的犯罪證據(jù)可以被檢驗(yàn)，確認(rèn)或免責(zé)很初被定罪的人。脫氧核糖核酸指紋中較小的區(qū)別有助于親子鑒定，在親子鑒定中，一個(gè)人和他的近親相匹配?？梢詼y試未知人類遺骸的DNA，并與可能的父母、兄弟姐妹或兒童進(jìn)行比較。類似的測試可以用來確認(rèn)被收養(yǎng)(或)孩子的親生父母。新生兒的實(shí)際生父也可以被確認(rèn)(或排除)。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)；變性溫度和時(shí)間 95℃，30s；退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃；延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽性：出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊，亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適：選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性，因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)非常敏感，有可能產(chǎn)生數(shù)百萬到數(shù)十億份特定產(chǎn)品的拷貝，用于測序、克隆和分析。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的步驟：標(biāo)準(zhǔn)的PCR過程分為三步：DNA變性：（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；退火：（60℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。延伸：（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性很好）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍?，F(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。上海特殊樣本Real-time PCR原理及步驟

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用

聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法：反應(yīng)緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設(shè)計(jì)引物。引物量過多。減少反應(yīng)體系中引物的用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50ng，而基因組DNA則應(yīng)<200ng。外源DNA污染。確保操作的潔凈。陰性對(duì)照出現(xiàn)條帶：試劑，頭，工作臺(tái)污染。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。條帶大小與理論不符：污染。使用全新的試劑和頭，對(duì)工作臺(tái)進(jìn)行清潔。模板或引物使用錯(cuò)誤。更換引物和模板?；騺喰?。對(duì)研究的基因進(jìn)行序列分析和BLAST研究。無錫組織PCR檢測技術(shù)應(yīng)用