武漢細(xì)胞熒光PCR方案

PCR的反應(yīng)條件：dNTP濃度過高會加快反應(yīng)速度，但同時還可以增加堿基的錯誤摻入率。引物濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增。TaqDNA聚合酶濃度過高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，低則合成產(chǎn)物量減少。TaqDNA聚合酶無校正功能，摻入錯誤率達(dá)2*E-4個核苷酸，一個30個循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)0.1%-0.25%總錯誤率。在90～95度下可使整個基因組的DNA變性為單鏈。一般94～95度30～60s。時間過長使TaqDNA聚合酶失活和dNTP破壞增多。DNA很快冷卻到40～60度使引物和模板結(jié)合。引物長度在15～25時退火溫度。如果基因的基因組DNA序列是已知的，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。武漢細(xì)胞熒光PCR方案

聚合酶鏈反應(yīng)：多重連接依賴探針擴(kuò)增（MLPA):允許用單個引物對擴(kuò)增多個靶標(biāo)，從而避免多重PCR的分辨率限制。多重聚合酶鏈反應(yīng):由單個PCR混合物中的多個引物組組成，以產(chǎn)生對不同DNA序列特異的不同大小的擴(kuò)增子。通過同時靶向多個基因，可以從單次測試中獲得額外的信息，否則將需要幾次試劑和更多時間來執(zhí)行。每個引物組的退火溫度必須優(yōu)化，以在單個反應(yīng)中正確工作，并符合擴(kuò)增子尺寸。也就是說，當(dāng)通過凝膠電泳可視化時，它們的堿基對長度應(yīng)該足夠不同以形成不同的條帶。武漢細(xì)胞熒光PCR方案序列間特異性聚合酶鏈反應(yīng)放大簡單重復(fù)序列之間的區(qū)域，以產(chǎn)生擴(kuò)增片段長度的獨特指紋。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)：反應(yīng)的控制：PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子；鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L；底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L；TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）；引物濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L；反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)；變性溫度和時間 95℃，30s；退火溫度和時間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃；延伸溫度和時間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）；Tm值=4(G+C) +2(A+T)；循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個左右，循環(huán)數(shù)超過30個以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺期”。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備：引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%，引物3′末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3‘端的堿基，特別是很末及倒數(shù)第二個堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，很好選擇是G和C。引物的5′端可以修飾。如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括起始密碼子、終止密碼子等。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中要確保反應(yīng)緩沖液融化完全并徹底混勻。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的很大特點是能將微量的DNA大幅增加。因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發(fā)、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進(jìn)行比對。這也是“微量證據(jù)”的威力之所在。由1983年美國首先提出設(shè)想，1985年由其發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)，即簡易DNA擴(kuò)增法，意味著PCR技術(shù)的真正誕生。到2013年，PCR已發(fā)展到第三代技術(shù)。聚合酶鏈反應(yīng)應(yīng)經(jīng)常使用帶有一次性柱塞和超長移液器吸頭的移液器。莆田組織RT-PCR檢測技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌、菌類等。武漢細(xì)胞熒光PCR方案

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題：陰性：需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴(kuò)增，對策為：選定一個好的引物合成單位。引物的濃度不但要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。武漢細(xì)胞熒光PCR方案