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Real-time PCR:Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定,因此,實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量較準(zhǔn)確,重現(xiàn)性較好的定量方法,已得到全世界的公認(rèn),普遍用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的定量方法,在Real-time PCR中,模板定量有兩種策略,相對(duì)定量和定量。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。武漢實(shí)時(shí)Real-time PCR供應(yīng)商
Real-time PCR鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的常見問題:靶序列變異:如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。假陽(yáng)性:出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時(shí)其條帶更整齊,亮度更高。引物設(shè)計(jì)不合適:選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。需重新設(shè)計(jì)引物。出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶:PCR擴(kuò)增有時(shí)出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起。其對(duì)策有:減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當(dāng)降低Mg2+濃度。增加模板量,減少循環(huán)次數(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)準(zhǔn)備:PCR所用的酶主要有兩種來源:Taq和Pfu,分別來自兩種不同的噬熱菌。武漢實(shí)時(shí)Real-time PCR供應(yīng)商電子聚合酶鏈反應(yīng)是指計(jì)算工具使用給定的一組引物來擴(kuò)增來自測(cè)序的基因組或轉(zhuǎn)錄組的DNA 序列。
Real-time PCR-傳統(tǒng)定量PCR:擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,而待測(cè)模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。PCR-ELISA法:利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物,擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體-辣根過氧化物酶結(jié)合物,之后酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),若加入內(nèi)標(biāo),作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
Real-time PCR操作流程:1、收集樣品。2相關(guān)試劑總RNA提取試劑TREzolReagent(RNA提取試劑),M-MLV(cDNA逆轉(zhuǎn)錄酶),RNA純化試劑,RealqPCRMasterMix(螢光定量PCR預(yù)混試劑)。3實(shí)驗(yàn)儀器螢光定量PCR儀;PCR儀;低溫離心機(jī)。4總RNA提取。5cDNA合成在0.5ml的離心管中加入1µl模板總RNA(1µg/µl);Real-time PCR操作流程:2µl隨機(jī)引物(T18,10pmol/ul);2µl10mMdNTPmix;加水至15µl體系?;靹蚝?0℃變性RNA5分鐘,冰上速冷1分鐘,離心將溶液收集至管底加入6µl5×PCRbuffer;1µlRNaseout;1µlM-MLVRT;加水至30µl體系。PCR儀中反應(yīng)條件設(shè)定37℃延伸60min,70℃保溫15min終止反應(yīng)。合成好的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩>酆厦告準(zhǔn)椒磻?yīng)中的DMSO、甘油等,主要用來保持酶的活性和幫助DNA解除纏繞結(jié)構(gòu)。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的試驗(yàn)污染:PCR反應(yīng)的很大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性,但令人腦袋不適的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生。污染原因:標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染,或標(biāo)本放置時(shí),由于密封不嚴(yán)溢于容器外,或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過程中,由于吸樣污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,導(dǎo)致彼此間的污染。PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。如果基因的基因組DNA序列是已知的,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)可以用來繪制基因中外顯子和內(nèi)含子的位置。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)較敏感、較準(zhǔn)確的方法。揚(yáng)州實(shí)時(shí)RT-PCR檢測(cè)技術(shù)
Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。武漢實(shí)時(shí)Real-time PCR供應(yīng)商
引物的設(shè)計(jì)對(duì)于這個(gè)實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,因?yàn)镽eal-time PCR的檢測(cè)靈敏度比較高,所以相應(yīng)的對(duì)引物設(shè)計(jì)的要求就很高。普通的要求規(guī)則大家都知道,還有幾點(diǎn)必須注意:1,引物的錯(cuò)配率(引物錯(cuò)配形成引物二聚體,但是SYBR照樣能嵌入進(jìn)去,結(jié)果導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的誤差很大,重復(fù)性也不好)。2,引物的特異性一定要高(不像常規(guī)PCR,引物同源性不高,只要兩條產(chǎn)物的片段長(zhǎng)度相差足夠大,在電泳的時(shí)候能夠區(qū)分開就可以。Real-time PCR只有在熔解曲線的時(shí)候能分開,所以這就造成整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差很大,不可信)。武漢實(shí)時(shí)Real-time PCR供應(yīng)商
上海司鼎生物科技有限公司是一家從事免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)研發(fā)、生產(chǎn)、銷售及售后的服務(wù)型企業(yè)。公司坐落在放鶴路1088號(hào),成立于2016-06-07。公司通過創(chuàng)新型可持續(xù)發(fā)展為重心理念,以客戶滿意為重要標(biāo)準(zhǔn)。在孜孜不倦的奮斗下,公司產(chǎn)品業(yè)務(wù)越來越廣。目前主要經(jīng)營(yíng)有免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)等產(chǎn)品,并多次以醫(yī)藥健康行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、客戶需求定制多款多元化的產(chǎn)品。我們以客戶的需求為基礎(chǔ),在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和研發(fā)上面苦下功夫,一份份的不懈努力和付出,打造了司鼎;OriCell產(chǎn)品。我們從用戶角度,對(duì)每一款產(chǎn)品進(jìn)行多方面分析,對(duì)每一款產(chǎn)品都精心設(shè)計(jì)、精心制作和嚴(yán)格檢驗(yàn)。上海司鼎生物科技有限公司以市場(chǎng)為導(dǎo)向,以創(chuàng)新為動(dòng)力。不斷提升管理水平及免疫印跡(WB)技術(shù)服務(wù),熒光定量PCR技術(shù)服務(wù),膜片鉗電生理技術(shù)服務(wù),在體光纖成像記錄技術(shù)服務(wù)產(chǎn)品質(zhì)量。本公司以良好的商品品質(zhì)、誠(chéng)信的經(jīng)營(yíng)理念期待您的到來!