溫州分子生物學定量PCR技術服務

Real-time PCR的染料法和探針法的選擇：進行mRNA表達量的測定，采用染料法是比較經(jīng)濟實惠的；染料法可以通過比較熔解曲線的熔解峰位置得到產(chǎn)物特異性的情況；目的基因和內參基因分管檢測，染料法可以選用Realtime染料PCRPreMIX，探針法主要應用于病毒RNA的檢測；以及單位點突變（SNP）；多基因的合并檢測，探針法還可用于同一個反應中同時檢測目的基因和內參基因的情況；而染料法則必須分管檢測。Real-time PCR：實時熒光定量PCR技術（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction簡稱Real-time PCR）是在定性PCR技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。實時熒光定量在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，之后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(orcDNA)的起始濃度進行定量的方法。Real-time PCR與普通PCR的實驗目的不同，所以對引物的設計要求也不同。溫州分子生物學定量PCR技術服務

實時熒光定量PCR：實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此，實時熒光定量PCR無需內標是建立在兩個基礎之上的：Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內擴增，得到的Ct值是恒定的。廈門微量RT-PCR檢測技術原理及步驟Real-time PCR探針法普遍用于人類傳染病的診斷和病原定量。

Real-time PCR實驗注意事項-防止RNA酶污染的措施：1.所有的玻璃器皿均應在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應盡可能的用0.1%DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設置RNA操作專業(yè)使用實驗室，所有器械等應為專業(yè)使用。

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數(shù)的檢測，RNAi基因失活率的檢測等；2.基因表達差異分析：例如比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等)，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA晶片或差顯結果的確證；3.基因分型：例如SNP檢測，甲基化檢測等。Real-time PCR常用的兩種方法分別為Sybrgreen（螢光染料摻入法）和Taqmanprobe（探針法）。Real-time PCR反是一項利用DNA雙鏈復制的原理。

所謂real-timeQ-PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基因，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，之后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。在real-time技術的發(fā)展過程中，兩個重要的發(fā)現(xiàn)起著關鍵的作用：（1）TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)，它能降解特異性熒光記探針，因此使得間接的檢測PCR產(chǎn)物成為可能。（2）此后熒光雙標記探針的運用使在一密閉的反應管中能實時地監(jiān)測反應全過程。這兩個發(fā)現(xiàn)的結合以及相應的儀器和試劑的商品化發(fā)展導致real-timeQ-PCR方法在研究工作中的運用。Real-time PCR主要指在PCR反應體系中加入熒光物質。南京血液熒光PCR網(wǎng)站

聚合酶鏈反應五要素：參加PCR反應的物質主要有五種即：引物、酶、dNTP、模板和緩沖液。溫州分子生物學定量PCR技術服務

Real-timePCR技術服務聚合酶鏈式反應的試驗污染：實驗室中克隆質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用克隆質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為克隆質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在活細胞內的質粒，由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。污染的監(jiān)測：一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。重復性試驗。選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。溫州分子生物學定量PCR技術服務

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