云南細(xì)胞pcr原理

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的兼并引物PCR（DegeneratePrimer）介紹：兼并引物是指代替編碼單個(gè)氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。兼并度越低，產(chǎn)物特異性越強(qiáng)。設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)盡量選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3’末端兼并，因?yàn)?'端末尾3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR；次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。因此，在引物設(shè)計(jì)時(shí),比較選擇兼并性小的氨基酸，并避免引物3'端被兼并，因?yàn)?'端末尾3個(gè)堿基的退火足以在錯(cuò)誤位點(diǎn)起始PCR;次黃嘌呤可以同所有的堿基配對(duì)，降低引物的退火溫度。實(shí)驗(yàn)證明，用脫氧肌苷引物進(jìn)行PCR,可以代替編碼蛋白的多種兼并密碼子中的兼并堿基。英瀚斯生物可承接臨床樣本、動(dòng)物組織、細(xì)胞樣本各類pcr檢測(cè)。云南細(xì)胞pcr原理

PCR樣本可分2種，DNA樣本和RNA樣本。一，DNA樣本：已經(jīng)提取好的DNA樣本，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；血液樣本，需全血，加入抗凝劑，抗凝管4度保存；組織樣本，需凍存管或干凈滅菌的離心管裝，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；細(xì)胞樣本，用胰酶消化后的細(xì)胞沉淀，負(fù)20度或負(fù)80度保存。二，RNA樣本：提取好的RNA樣本，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；血液樣本，全血，加入抗凝劑，4度冰箱保存；組織樣本，凍存管或干凈滅菌離心管，負(fù)80度保存，干冰運(yùn)輸；細(xì)胞樣本，用胰酶消化后的細(xì)胞沉淀，負(fù)20度或負(fù)80度保存。長(zhǎng)時(shí)間保存，可加Trizol，其中血液用TrizolLS組織和細(xì)胞沉淀用Trizol。湖北樣本pcr外包如何挑選pcr檢測(cè)試劑盒？

PCR設(shè)計(jì)引物應(yīng)遵循以下原則：①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。②引物擴(kuò)增跨度：以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC比較好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3'端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。⑤引物3'端的堿基，特別是較末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。⑥引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)，被擴(kuò)增的靶序列比較好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以比較低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)。

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點(diǎn)介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴(kuò)增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡(jiǎn)化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測(cè)非常有利。用一步法擴(kuò)增可檢測(cè)出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時(shí)RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴(kuò)增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個(gè)反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點(diǎn)，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個(gè)基因的RT-PCR。一步法熒光定量pcr在哪做？

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的Touch-downPCR介紹：Touch-downPCR又稱降落PCR.即選定一個(gè)溫度范圍，如50—35℃，每降1-2℃進(jìn)行1-2個(gè)循環(huán)，然后在50度下進(jìn)行15個(gè)循環(huán)。Touch-down的原理隨著退火溫度的降低，特異性逐步降低，但特異性條帶在溫度較高時(shí)已經(jīng)擴(kuò)增出來(lái)，其濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)非特異性條帶，隨著退火溫度的降低，特異性條帶優(yōu)先被擴(kuò)增。選擇初始復(fù)性溫度的原則起始復(fù)性溫度應(yīng)該比引物的Tm值高出5-10度，然后每個(gè)循環(huán)遞減1-2度Touch-downPCR的應(yīng)用范圍lowcopyoftargetedDNA;highdegreedegeneracy(orlessspecific)ofthefirstsetofprimers;做pcr，樣本該如何保存？黑龍江什么是pcr哪家好

簡(jiǎn)述熒光定量pcr的基本原理。云南細(xì)胞pcr原理

PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)中的巢氏PCR（NestedPCR）介紹：巢氏PCR需要兩到三對(duì)引物，一般采用較為套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，再用擴(kuò)增DNA的片段內(nèi)設(shè)定的第二套引物擴(kuò)增15-30個(gè)循環(huán)，這樣可使待擴(kuò)增序列得到高效擴(kuò)增，而次級(jí)結(jié)構(gòu)卻很少擴(kuò)增。套式引物PCR減少了引物非特異性退火，從而增加了特異性擴(kuò)增，提高了擴(kuò)增效率。若將套失PCR的內(nèi)外引物稍加改變，延長(zhǎng)外引物長(zhǎng)度（25-30bp），同時(shí)縮短內(nèi)引物長(zhǎng)度（15-17bp），使外引物先在高退火溫度下復(fù)性，做雙溫?cái)U(kuò)增，然后改換至三溫循環(huán)，使內(nèi)引物在外引物擴(kuò)增的基礎(chǔ)上，在低退火溫度復(fù)性，直到擴(kuò)增完成，這樣就可以使兩套引物一次同時(shí)加入。云南細(xì)胞pcr原理

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