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PCR實驗技術(shù)中的RT-PCR一步法和兩步法的優(yōu)缺點介紹：一步法：利用同一緩沖液，在同一體系中加入逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、Taq酶、4種dNTP直接進(jìn)行mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR擴增。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后PCR擴增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡化。所需樣品量減少到比較低限度，臨床小樣品的檢測非常有利。用一步法擴增可檢測出總RNA中小于1ng的低豐度mRNA.該法可用于低豐度mRNA的cDNA文庫的構(gòu)建及特異cDNA的克隆，并有可能與Taq酶的測序技術(shù)相組合，使得自動反轉(zhuǎn)錄、基因擴增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序在單管中進(jìn)行。兩步法：由于單管反應(yīng)時RT和PCR都不能在比較好條件下進(jìn)行并且容易相互干擾，常只適宜用基因特異引物擴增較短的基因，及定量PCR.兩步法則是將RT和PCR分別進(jìn)行，這樣使得兩個反應(yīng)充分發(fā)揮各自的特點，更為靈活而且嚴(yán)謹(jǐn)，適合那些GC含量、二級結(jié)構(gòu)嚴(yán)重的模板或者是未知模板，以及多個基因的RT-PCR。英瀚斯生物，確保pcr檢測結(jié)果真實性。云南樣本pcr外包

PCR反應(yīng)的比較大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但令人頭疼的問題是易污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。主要原因有：1、標(biāo)本間交叉污染；2、PCR試劑的污染；3、PCR擴增產(chǎn)物污染；4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染。一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標(biāo)志。2、陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括：（1）標(biāo)本對照：被檢的標(biāo)本是血清就用鑒定后的正常血清作對照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對照。（2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。3、重復(fù)性試驗。4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴增。云南樣本pcr外包什么是pcr的溶解曲線？

PCR實驗技術(shù)中的反向PCR（InversePCR）介紹：反向PCR起初設(shè)計用于確定臨近未知區(qū)域的序列。反向PCR有助于研究一個基因的啟動子序列；致*染色體重排如基因融合、異位或轉(zhuǎn)移；及病毒基因的整合。之所以稱為反向PCR，是因為引物設(shè)計用于向兩邊延伸而不像常規(guī)PCR中朝著彼此延伸。如今，反向PCR常用于定點突變，復(fù)制一個具有預(yù)期突變的目的質(zhì)粒。在研究基因組DNA未知序列的傳統(tǒng)實驗流程中，限制性內(nèi)切酶消化和連接先于反向PCR，接著對PCR擴增子進(jìn)行測序。對于gDNA消化，需選擇一種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切以獲得合適長度可自連的片段。同時，所選擇的內(nèi)切酶不應(yīng)該切割已知序列，所以連接發(fā)生于側(cè)翼的未知序列之間。使用低濃度的酶切DNA的片段以助于片段自連而非多個片段連接。片段自連完成后，通過反向PCR擴增DNA的位置區(qū)域。獲得的擴增子兩端包含一部分已知序列。之后通過測序以鑒定臨近已知序列的未知區(qū)域。

PCR是一種具有選擇性的體外擴增DNA的片段的方法。其特異性由兩個人工合成的引物DNA序列決定。所謂引物是指與待擴增核酸片段兩端互補的寡核苷酸，其本質(zhì)是ssDNA(單鏈DNA)的片段。指在引物指導(dǎo)下由酶催化的對特定模板（克隆或基因組DNA）的擴增反應(yīng)，是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制過程，在體外特異性擴增基因片段的一種技術(shù)，在分子生物學(xué)中有普遍的應(yīng)用，包括用于DNA作圖、DNA測序、分子系統(tǒng)遺傳學(xué)等。CR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。pcr檢測實驗成功的訣竅！

PCR方法主要可以分為三類：終點PCR、qPCR和dPCR。終點PCR終點PCR是較原始、較簡單的PCR方法，如今仍在被我們普遍使用。使用者只能在PCR反應(yīng)結(jié)束之后，通過凝膠電泳、毛細(xì)管電泳等方法對產(chǎn)物進(jìn)行檢測。終點PCR本身是無法定量的，因為該反應(yīng)產(chǎn)出的DNA量不一定能反映較初情況。舉例來說，不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。qPCR和dPCR研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰(zhàn)：實時定量PCR（qPCR）和數(shù)字PCR（dPCR）。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針（比如TaqMan），人們可以通過監(jiān)控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。數(shù)字PCR（dPCR）的基本工作原理很簡單，先將樣品劃分為多個PCR反應(yīng)，每個反應(yīng)較多只含有一個模板。然后通過計數(shù)正負(fù)反應(yīng)來確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。pcr檢測主要是檢測什么？河南靠譜pcr多少錢

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細(xì)胞長滿80%瓶底或皿底，換培養(yǎng)液，第二天提取RNA(倒掉培養(yǎng)液，5-10ml冰PBS洗滌細(xì)胞2次空干)加1ml冰TRizoL,用力振蕩培養(yǎng)瓶使細(xì)胞完全脫落，加樣器吹打(吸入1.5ml離心管，旋渦振蕩10秒，室溫靜置5分鐘)加氯仿200ul,漩渦混勻器振蕩10秒，冰盒上靜置10分鐘(40C,8000rpm,5分鐘，)吸取上層水相0.5-0.7ml移至另一1.5ml離心管中，加異丙醇0.5-0.7ml(充分混勻，冰盒上靜置10分鐘，40C,12000rpm,15分)棄上清,加75%冰乙醇1ml,顛倒混勻數(shù)次(40C,12000rpm,15分)棄上清,沉淀快速風(fēng)干。但不要完全干燥,加DEPC處理去離子水50-100ul取5ul作RNA電泳，5ul作RNA定量，余-800C冰箱保存云南樣本pcr外包

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