上海crispr脫靶檢測(cè)方法

CIRCLE-Seq，將gDNA打斷并環(huán)化，環(huán)化的DNA與CRISPR/RNP孵育，NGS測(cè)序檢測(cè)線性化的DNapian段，確定脫靶位點(diǎn)。PCR富集后測(cè)序，成本相對(duì)較低，能檢測(cè)低頻脫靶突變。安必奇sgRNA脫靶效應(yīng)評(píng)估，安必奇生物提供sgRNA脫靶效應(yīng)評(píng)估服務(wù)，幫助您挑選高度特異，脫靶率低的sgRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，我們也協(xié)助您檢測(cè)分析基因編輯后細(xì)胞樣品的脫靶情況，通過各種高通量測(cè)序檢測(cè)技術(shù)，我們能準(zhǔn)確的分析全基因組范圍內(nèi)的脫靶位點(diǎn)，推動(dòng)CRISPR/Cas9技術(shù)在zhiliao藥物開發(fā)和臨床研究中的應(yīng)用。我們的優(yōu)勢(shì)：靈敏度高：能檢測(cè)低頻脫靶突變★準(zhǔn)確性高：檢測(cè)結(jié)果可通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證★多種檢測(cè)方法可選擇以滿足不同的實(shí)驗(yàn)需求定量脫靶檢測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。上海crispr脫靶檢測(cè)方法

BLESS：利用生物素標(biāo)簽對(duì)DSBs進(jìn)行原位標(biāo)記，后經(jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物素標(biāo)記片段的富集，并通過二代測(cè)序?qū)崿F(xiàn)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)。直接檢測(cè)細(xì)胞中的切割位點(diǎn)，靈敏度與細(xì)胞、組織密切相關(guān)。LAM-HTGTS，片段化的gDNA經(jīng)過LAM-PCR引入接頭，然后進(jìn)行全基因組易位測(cè)序。高通量的全基因組范圍檢測(cè)，可準(zhǔn)確檢測(cè)DSBs引發(fā)的重排。GUIDE-Seq，將dsODN    s標(biāo)簽整合到DSBs位點(diǎn)，通過二代測(cè)序檢測(cè)這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，從而確定脫靶突變的位置。廣使用的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)方法。能檢測(cè)低頻脫靶突變。Digenome-Seq，片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進(jìn)行全基因組測(cè)序檢測(cè)脫靶。全基因組測(cè)序，直接檢測(cè)切割位點(diǎn)，能檢測(cè)低頻脫靶突變。江蘇基因療法脫靶檢測(cè)評(píng)估內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng)。

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發(fā)表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機(jī)打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環(huán)狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機(jī)斷裂造成的背景噪聲。實(shí)驗(yàn)的第二步是用Cas9切割環(huán)狀DNA，再連上接頭并進(jìn)行雙端測(cè)序，這樣就可以在一次測(cè)序中同時(shí)獲取切割位點(diǎn)的兩側(cè)序列，彌補(bǔ)了SITE-seq的另一個(gè)缺點(diǎn)。CIRCLE-seq從總體上來說要優(yōu)于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機(jī)打斷后成環(huán)的效率并不高，所以同一作者在3年后發(fā)表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環(huán)效率，降低了起始基因組DNA的用量。

自基因zhiliao出現(xiàn)之日起，安全性問題就隨之產(chǎn)生了，并成為阻礙基因zhiliao研發(fā)的一大障礙，吳寧博士認(rèn)為：“基因zhiliao產(chǎn)品的研發(fā)和上市，安全性會(huì)將是一個(gè)非常重要考量。如果一款產(chǎn)品它安全性有問題的話，在市場(chǎng)化道路上就會(huì)受到很大影響。尤其是基因zhiliao，目前處于起始階段，一旦出現(xiàn)不良事件，很有可能對(duì)整個(gè)行業(yè)都會(huì)產(chǎn)生致命打擊。具體說來，基因zhiliao的安全性問題主要涉及基因插入突變、脫靶、生物分布和持久性、潛伏再jihuo以及潛在免疫原性等。”如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶? 基因編輯的脫靶率檢測(cè)一般有兩種方法。

細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性，同時(shí)也會(huì)帶來新的安全性風(fēng)險(xiǎn)，如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等。在制定非臨床研究計(jì)劃時(shí)，除參考《細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中的對(duì)細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品的一般要求外，還應(yīng)具體問題具體分析，基于產(chǎn)品特點(diǎn)和目前已有的科學(xué)認(rèn)知，結(jié)合擬定適應(yīng)癥、患者人群、給藥途徑和給yaofang案等方面的考慮，科學(xué)合理的設(shè)計(jì)和實(shí)施非臨床研究，充分表征產(chǎn)品的藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特征。在進(jìn)行獲益風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注由非臨床向臨床過渡時(shí)非臨床研究的局限性和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)的不確定性。脫靶檢測(cè)評(píng)估，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。南通種子基因脫靶檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室

脫靶檢測(cè)CRO，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。上海crispr脫靶檢測(cè)方法

細(xì)胞外檢測(cè)方法：細(xì)胞外檢測(cè)方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測(cè)序流程獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息?？傮w來講，這種方法測(cè)序成本較高，并且檢測(cè)靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測(cè)到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫(kù)時(shí)定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測(cè)序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點(diǎn)末端連接帶Biotin的接頭；再隨機(jī)打斷基因組，在另一端連接第二個(gè)接頭；經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測(cè)序，實(shí)現(xiàn)了CRISPR切割位點(diǎn)的富集。該方法雖然提高了脫靶位點(diǎn)的檢測(cè)靈敏度，但有著較高的實(shí)驗(yàn)要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無(wú)法區(qū)分提純基因組DNA時(shí)發(fā)生的隨機(jī)斷裂和Cas9的切割，導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號(hào)。同時(shí)，由于一輪Biotin接頭只會(huì)接在Cas9切割位點(diǎn)的一側(cè)，導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果里只能看到脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。上海crispr脫靶檢測(cè)方法