使用基因編碼的熒光探針可以在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào),這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。使用雙光子顯微鏡(2PM)可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng);成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),目前電壓成像主要通過(guò)寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,通過(guò)FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,虛擬源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,雙光子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用,可以觀察細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)分布、細(xì)胞活動(dòng)等。國(guó)外investigator雙光子顯微鏡光子探測(cè)
雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù),可以在保持細(xì)胞活性的情況下,對(duì)深層組織進(jìn)行高分辨率成像。它主要用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。雙光子顯微鏡的重心技術(shù)是基于雙光子激發(fā)的熒光成像。當(dāng)激光通過(guò)樣品時(shí),它會(huì)吸收特定波長(zhǎng)的光子,然后發(fā)出熒光。雙光子顯微鏡使用兩個(gè)連續(xù)的光子同時(shí)激發(fā)樣品,這樣可以在保持樣品完整性的同時(shí),獲得高質(zhì)量的圖像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn):1.高分辨率:由于雙光子激發(fā)的特性,它可以獲得比傳統(tǒng)顯微鏡更高的分辨率。2.深層成像:由于激光的穿透深度限制,傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無(wú)法對(duì)深層組織進(jìn)行成像。而雙光子顯微鏡可以解決這個(gè)問(wèn)題,因?yàn)樗梢约ぐl(fā)樣品的深層熒光。3.活細(xì)胞成像:雙光子顯微鏡可以在保持細(xì)胞活性的情況下進(jìn)行成像,這對(duì)于研究細(xì)胞生理學(xué)和生物化學(xué)過(guò)程非常有用。4.多模式成像:雙光子顯微鏡可以結(jié)合多種技術(shù),如光譜成像、鈣離子成像和神經(jīng)活動(dòng)成像等,以提供更豐富的生物樣品信息。總之,雙光子顯微鏡是一種強(qiáng)大的研究工具,可以對(duì)深層組織和活細(xì)胞進(jìn)行無(wú)損成像。這使得它在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究中具有廣泛的應(yīng)用。進(jìn)口熒光雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式雙光子顯微鏡大量運(yùn)營(yíng)在實(shí)驗(yàn)室當(dāng)中;
雙光子顯微鏡的基本原理是:在高光子密度的情況下,熒光分子可以同時(shí)吸收2個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子,在經(jīng)過(guò)一個(gè)很短的所謂激發(fā)態(tài)壽命的時(shí)間后,發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子;其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的。雙光子激發(fā)需要很高的光子密度,為了不損傷細(xì)胞,雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖寬度只有100飛秒,而其周期可以達(dá)到80至100兆赫茲。在使用高數(shù)值孔徑的物鏡將脈沖激光的光子聚焦時(shí),物鏡的焦點(diǎn)處的光子密度是比較高的,雙光子激發(fā)只發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)上,所以雙光子顯微鏡不需要共聚焦***,提高了熒光檢測(cè)效率。
其實(shí)電子顯微鏡相比光學(xué)顯微鏡的重要優(yōu)勢(shì)或意義不在于放大倍數(shù),而在于超高的分辨率。這兩者是不同的。一般來(lái)說(shuō),觀察時(shí),除了放大物體外,還需要將其與其他相鄰物體區(qū)分開(kāi)來(lái)。如果兩個(gè)相鄰粒子的圖像在光學(xué)顯微鏡下,即使放大很大程度,也可能看到兩個(gè)相交的亮點(diǎn)(艾里斑),沒(méi)有明顯的邊界(更不用說(shuō)細(xì)節(jié)了),說(shuō)明分辨率不夠。沒(méi)有分辨率談放大是沒(méi)有意義的。光學(xué)顯微鏡的分辨率極限是阿貝極限,大約是光波波長(zhǎng)的一半。通常稱(chēng)之為光學(xué)顯微鏡的放大極限,但準(zhǔn)確的說(shuō)應(yīng)該叫分辨率極限。原因是光的衍射,根本原因是光的波粒二象性。電子衍射實(shí)驗(yàn)證明了電子的波動(dòng)性,所以在電子顯微鏡中用電子代替光是可能的。電子顯微鏡也有很多種,被攝體像REM。也有根據(jù)衍射規(guī)律觀察的電子顯微鏡,如低能電子衍射(LEED)和透射電子顯微鏡(TEM)。兩者主要用于觀察晶體,根據(jù)晶體的周期特性在倒易空間產(chǎn)生衍射像,借助埃爾沃德球或傅里葉變換將其變換到實(shí)空間,即可得到真實(shí)的晶體表面像。雙光子顯微鏡可精確穿透較厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)、有生命體的觀察!
雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì):在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)活細(xì)胞成像,雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。雙光子和共聚焦顯微鏡都是通過(guò)激光激發(fā)樣品中的熒光標(biāo)記,使用探測(cè)器測(cè)量被激發(fā)的熒光。但是,共聚焦一般使用單模光纖耦合激光器,通過(guò)單光子激發(fā)熒光,而雙光子使用飛秒激光器,通過(guò)幾乎同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波光子激發(fā)熒光。下面是兩種技術(shù)的對(duì)比圖。雙光子激發(fā)熒光的主要優(yōu)勢(shì):雙光子比共聚焦使用的更長(zhǎng)的波長(zhǎng),所以對(duì)組織的損傷更小且穿透更深。共聚焦的成像深度一般為100微米,雙光子則能達(dá)到250到500微米,甚至超過(guò)1毫米。另外,同時(shí)吸收兩個(gè)光子意味只有較強(qiáng)度聚焦點(diǎn)處能被激發(fā),所以不會(huì)損傷焦平面之外的組織,并且生成更清晰的圖像。上海雙光子顯微鏡就找因斯蔻浦。國(guó)外熒光激光雙光子顯微鏡成像視野是多少
雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。國(guó)外investigator雙光子顯微鏡光子探測(cè)
高光子密度帶來(lái)的高能量容易損傷細(xì)胞,所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬(wàn)億分之一秒,而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,又能不損傷細(xì)胞,使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例生物領(lǐng)域:貝爾實(shí)驗(yàn)室的Svoboda等人研究了大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)力學(xué)情形。利用雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴(lài)于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。信息領(lǐng)域:美國(guó)科學(xué)家Rentzepis提出了一種在現(xiàn)有二維光盤(pán)的基礎(chǔ)上將數(shù)據(jù)儲(chǔ)存擴(kuò)展到三維空間。由于雙光子激發(fā)具有作用精細(xì)體積小的特點(diǎn),避免了層與層之間的互相干擾,極大地提高了數(shù)據(jù)儲(chǔ)存密度。國(guó)外investigator雙光子顯微鏡光子探測(cè)