原代細(xì)胞的幾大特點(diǎn):1、生命的起源原代細(xì)胞人體起源一個(gè)單細(xì)胞受精卵(*代干細(xì)胞),經(jīng)歷卵裂(干細(xì)胞持續(xù)擴(kuò)增,增加細(xì)胞數(shù)量)、胚層出現(xiàn)(干細(xì)胞開(kāi)始分化出功能細(xì)胞)、組織部位形成(功能細(xì)胞的有序排列)及胚后發(fā)育這樣一個(gè)連續(xù)過(guò)程。2、維持人體動(dòng)態(tài)平衡的種子細(xì)胞人體通過(guò)干細(xì)胞化來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞更新。成年并不意味著細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化的結(jié)束,而仍然存在著受調(diào)控的組織更新過(guò)程。在一些組織中,如骨髓、表皮等,新細(xì)胞可不斷地產(chǎn)生,以補(bǔ)充因分化而衰老、死亡的細(xì)胞。干細(xì)胞的增殖保持著機(jī)體內(nèi)細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡原代細(xì)胞作為更接近體內(nèi)環(huán)境的研究模型。溫州開(kāi)封原代細(xì)胞分離試劑盒細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)及常見(jiàn)問(wèn)題解答:1、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種...
原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用,市場(chǎng)前景廣闊。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此,較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),如果是正常細(xì)胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上,通常把靠前代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞如何傳代接種:原代細(xì)胞(primaryculturecell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅普遍應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究,如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學(xué)研究等,還可應(yīng)用于當(dāng)今熱...
保存條件:-20℃保存,一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存,PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mMPMSF溶液前可以室溫保存。注意事項(xiàng):1.試劑盒中的試劑對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟槐厝渴褂谩?.如果不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中不必加入PMSF。3.如果用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線(xiàn)粒體分離試劑或線(xiàn)粒體裂解液加入到樣品中前4.2-3分鐘內(nèi)加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。5.分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行,所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。6.通常在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600...
使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1.細(xì)胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%;如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,接種密度可以密一些,細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,靠前次使用建議您用24孔板做,每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件(siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例)放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可~會(huì)極大提高原代培養(yǎng)的細(xì)胞在體外存活率。南京原...
原代細(xì)胞的培養(yǎng)與建系細(xì)胞的來(lái)源多樣,培養(yǎng)方法也各不相同,凡是來(lái)源于胚胎、組織部位及外周血,經(jīng)特殊分離方法制備而來(lái)的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱(chēng)之為原代細(xì)胞。原代細(xì)胞經(jīng)分散接種之手段稱(chēng)為傳代。凡能經(jīng)傳代方式進(jìn)行再次培養(yǎng)的細(xì)胞稱(chēng)為傳代細(xì)胞。若能穩(wěn)定生長(zhǎng)傳至10~20代以上的細(xì)胞可確立為細(xì)胞系。若有條件能開(kāi)展單細(xì)胞克隆、純化,經(jīng)大量擴(kuò)增后所形成的生物學(xué)特性穩(wěn)定的克隆化細(xì)胞群,稱(chēng)之為細(xì)胞株或克隆細(xì)胞。此過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞的純化或細(xì)胞克隆。這些基本技術(shù)是從事細(xì)胞培養(yǎng)工作的基礎(chǔ),只有熟悉和掌握了基本技術(shù),才可能更快捷地學(xué)習(xí)和掌握其他方法,本章重點(diǎn)敘述常用的基本技術(shù)??壳肮?jié)原代細(xì)胞的取材人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的...
正向選擇VS負(fù)向選擇細(xì)胞分離試劑盒的工作原理主要有兩種,正向選擇和負(fù)向選擇。正向選擇的試劑盒,使用與目標(biāo)細(xì)胞直接結(jié)合的抗體來(lái)進(jìn)行捕獲。這種抗體通常與磁珠相連,可以利用磁鐵將懸液中的抗體-磁珠-細(xì)胞復(fù)合物提取出來(lái),再通過(guò)二抗將磁珠與目標(biāo)細(xì)胞分開(kāi)。負(fù)向選擇的試劑盒也采用類(lèi)似的抗體包被磁珠,不過(guò)這種試劑盒是通過(guò)去除樣品中的非目的細(xì)胞,來(lái)間接捕獲目的細(xì)胞。一款合適的細(xì)胞分離試劑盒可以說(shuō)是實(shí)驗(yàn)成功的保障,因?yàn)橹挥蝎@得正確的細(xì)胞,下游的分析結(jié)果才可能準(zhǔn)確。目前,市面上有多種多樣的分離試劑盒可供選擇,它們的主要區(qū)別在于分離方法和篩選標(biāo)志。那么,如何選擇較適合自己的細(xì)胞分離試劑盒呢?希望本文能為你提供一些幫助...
細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)及常見(jiàn)問(wèn)題解答:1、培養(yǎng)基的選擇依細(xì)胞種類(lèi)而定。如果是從別的實(shí)驗(yàn)室借來(lái)的細(xì)胞,較初階段一定要保持細(xì)胞原有的培養(yǎng)條件;特殊種類(lèi)的細(xì)胞,比如內(nèi)皮細(xì)胞,可以借鑒網(wǎng)上培養(yǎng)成功的條件,添加一些特定成分。2、液體培養(yǎng)基的保存條件應(yīng)是冰箱4度冷藏。小六兒見(jiàn)過(guò)有的大實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞量多,一次性購(gòu)買(mǎi)的培養(yǎng)基瓶數(shù)也多,有些人可能覺(jué)得-20冰箱保存時(shí)間會(huì)更久一些。但是經(jīng)過(guò)冷凍后的培養(yǎng)基再溶化時(shí),你會(huì)發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基的顏色發(fā)生變化,顏色變深,這就是培養(yǎng)基的PH值升高了。3、培養(yǎng)基中都含有大量的谷氨酰胺,用來(lái)合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需要的核酸和蛋白質(zhì)。但是谷氨酰胺在溶液中不穩(wěn)定,保存4周后的培養(yǎng)基需要重新加入谷氨酰胺。所以盡...
保存條件:-20℃保存,一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存,PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mMPMSF溶液前可以室溫保存。注意事項(xiàng):1.試劑盒中的試劑對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟槐厝渴褂谩?.如果不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中不必加入PMSF。3.如果用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線(xiàn)粒體分離試劑或線(xiàn)粒體裂解液加入到樣品中前4.2-3分鐘內(nèi)加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。5.分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行,所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。6.通常在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600...
注意事項(xiàng):所有相關(guān)器皿耗材都應(yīng)為RNase-free產(chǎn)品,操作過(guò)程要小心,帶口罩、手套避免環(huán)境中RNA酶污染樣品。RNA在水溶液中OD值可能在1.5-1.9之間,但這并不表示RNA不純,需電泳檢測(cè)。使用時(shí)一定要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)需要購(gòu)買(mǎi)提取試劑盒,如果不是試劑盒,或許能提出RNA,但不能確保其質(zhì)量以及完整性,會(huì)影響RT-PCR、Northernblot、Dotblot、RealtimeRTPCR、芯片分析、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護(hù)分析、分子克隆等后續(xù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。當(dāng)前提取效果好的是RNA提取試劑盒,但其售價(jià)較高,單次實(shí)驗(yàn)費(fèi)用花費(fèi)太大,對(duì)精度要求不高的實(shí)驗(yàn)沒(méi)有必要購(gòu)買(mǎi),當(dāng)然還有其它的進(jìn)...
關(guān)于細(xì)胞株和細(xì)胞系以及原代細(xì)胞的區(qū)別:1、獲取方法不同,原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞;細(xì)胞株是通過(guò)選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物;細(xì)胞系是原代細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)開(kāi)始傳代成功后所繁殖的細(xì)胞群體。2、原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了,細(xì)胞的生長(zhǎng)就會(huì)出現(xiàn)停滯,大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過(guò)“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去,這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40--50代,這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株;細(xì)胞株的遺傳物質(zhì)沒(méi)有發(fā)生改變。當(dāng)細(xì)胞傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)”,不能再傳下去。但是有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變,并且?guī)в凶兊奶攸c(diǎn),有可能在培養(yǎng)條...
原代細(xì)胞與細(xì)胞系該如何選:原代細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,一般認(rèn)為,原代細(xì)胞培養(yǎng)的第1代和傳代到第10代以?xún)?nèi)統(tǒng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞一般傳至10代左右就不容易傳下去了,細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)出現(xiàn)停滯,大部分細(xì)胞衰老死亡。但是有極少數(shù)的細(xì)胞能夠度過(guò)“危機(jī)”而繼續(xù)傳下去,這些存活的細(xì)胞一般能夠傳到40-50代,這種傳代細(xì)胞叫做細(xì)胞株。當(dāng)細(xì)胞傳至50代以后又會(huì)出現(xiàn)“危機(jī)”,這時(shí)有部分細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生了改變且?guī)в凶兊奶攸c(diǎn),從而可能無(wú)限制地傳代下去,這種傳代細(xì)胞稱(chēng)為細(xì)胞系。并且培養(yǎng)基中需包含細(xì)胞類(lèi)型特定的營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、葡萄糖和/或物品。南京正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒廠家供應(yīng)原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和...
這種有限的分裂能力體內(nèi)的細(xì)胞相似,一旦細(xì)胞在體內(nèi)完全分化以發(fā)揮其特殊功能,細(xì)胞將停止增殖-這是固有的保護(hù)性衰老過(guò)程。此外,某些原代細(xì)胞有絲分裂后,無(wú)論是在體內(nèi)或體外培養(yǎng)中都不增殖(例如,神經(jīng)元,骨骼肌細(xì)胞,心肌細(xì)胞,周細(xì)胞,終末分化的肝細(xì)胞)。因此,每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后,原代細(xì)胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離。原代細(xì)胞應(yīng)用困局:經(jīng)過(guò)一次傳代后,原代細(xì)胞培養(yǎng)物就會(huì)成為二級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物,也稱(chēng)為細(xì)胞株。然而,盡管稱(chēng)為細(xì)胞株,但其壽命是有限的(除非如前所述永生化)使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖(注意整個(gè)過(guò)程無(wú)菌)。徐州正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒哪家便宜保存條件:-20℃保存,一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存...
原代細(xì)胞的獲取:1.培養(yǎng)時(shí)間無(wú)論是酶消化法還是組織塊法,取樣后培養(yǎng)時(shí)間較少需要一周以上的時(shí)間,期間可換液或者傳代。2.換液時(shí)間無(wú)論酶消化法還是組織塊法,在培養(yǎng)期間需要隨時(shí)關(guān)注細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,需觀察其是否貼壁,是否污染,組織塊法要觀察是否有細(xì)胞遷移出來(lái)。正常情況下48~72h可換液一次。3.細(xì)胞狀態(tài)判斷正常貼壁細(xì)胞在培養(yǎng)幾天后,會(huì)逐漸貼滿(mǎn)整個(gè)瓶底或者皿底,有的呈纖維狀,有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細(xì)胞圖(左:小鼠成纖維細(xì)胞;右:雞胚成纖維細(xì)胞;下:人成纖維細(xì)胞)。盡快使接種的細(xì)胞貼壁,是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒產(chǎn)品介紹原代細(xì)胞的獲取:酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶...
使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1.細(xì)胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%;如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,接種密度可以密一些,細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,靠前次使用建議您用24孔板做,每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件(siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例)放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可~原代細(xì)胞作為更接近體內(nèi)環(huán)境的研究模型。石家莊...
保存條件:-20℃保存,一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存,PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mMPMSF溶液前可以室溫保存。注意事項(xiàng):1.試劑盒中的試劑對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟槐厝渴褂谩?.如果不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中不必加入PMSF。3.如果用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線(xiàn)粒體分離試劑或線(xiàn)粒體裂解液加入到樣品中前4.2-3分鐘內(nèi)加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。5.分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行,所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。6.通常在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600...
膠原酶的配制:建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配)。胰酶(酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶,相關(guān)文章也蠻多的)膠原酶消化時(shí)間:根據(jù)組織特性,消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例,加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,期間每10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎完全消失為止(若是組織塊剪得非常細(xì)小,時(shí)間可以短一些,30min左右即可)。原代細(xì)胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶。將凍存管快速的放入37℃水浴中,輕輕握住并旋轉(zhuǎn),直到管內(nèi)物體完全融化。珠海原代細(xì)胞分離試劑盒廠家推薦...
正向選擇VS負(fù)向選擇細(xì)胞分離試劑盒的工作原理主要有兩種,正向選擇和負(fù)向選擇。正向選擇的試劑盒,使用與目標(biāo)細(xì)胞直接結(jié)合的抗體來(lái)進(jìn)行捕獲。這種抗體通常與磁珠相連,可以利用磁鐵將懸液中的抗體-磁珠-細(xì)胞復(fù)合物提取出來(lái),再通過(guò)二抗將磁珠與目標(biāo)細(xì)胞分開(kāi)。負(fù)向選擇的試劑盒也采用類(lèi)似的抗體包被磁珠,不過(guò)這種試劑盒是通過(guò)去除樣品中的非目的細(xì)胞,來(lái)間接捕獲目的細(xì)胞。一款合適的細(xì)胞分離試劑盒可以說(shuō)是實(shí)驗(yàn)成功的保障,因?yàn)橹挥蝎@得正確的細(xì)胞,下游的分析結(jié)果才可能準(zhǔn)確。目前,市面上有多種多樣的分離試劑盒可供選擇,它們的主要區(qū)別在于分離方法和篩選標(biāo)志。那么,如何選擇較適合自己的細(xì)胞分離試劑盒呢?希望本文能為你提供一些幫助...
原代細(xì)胞培養(yǎng)的開(kāi)始傳代:原代培養(yǎng)后由于懸浮細(xì)胞增殖,數(shù)量增加甚至達(dá)飽和密度;貼壁細(xì)胞的相互匯合,使整個(gè)瓶底逐漸被細(xì)胞覆蓋,細(xì)胞難以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖,需要進(jìn)行分瓶培養(yǎng),這種使原代細(xì)胞經(jīng)分散接種的過(guò)程稱(chēng)之為傳代。值得注意的是:每次傳代細(xì)胞在生長(zhǎng)和增殖方面受到一定的影響。開(kāi)始傳代應(yīng)注意以下幾點(diǎn):①細(xì)胞生長(zhǎng)密度不高時(shí),不能急于傳代。②原代培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞需控制消化時(shí)間。③吹打已消化的細(xì)胞應(yīng)減少機(jī)械損傷。④開(kāi)始傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些。⑤開(kāi)始傳代培養(yǎng)的pH應(yīng)偏低些。小牛血清濃度可加大至15%~20%左右。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng)。金華重慶原代細(xì)胞分離試劑盒原代細(xì)胞在生物...
使用RFect系列小核酸轉(zhuǎn)染試劑做siRNA/miRNA轉(zhuǎn)染測(cè)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):1.細(xì)胞接種:一般做轉(zhuǎn)染前現(xiàn)在接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),使做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度在30-50%;如果細(xì)胞是原代細(xì)胞,接種密度可以密一些,細(xì)胞計(jì)數(shù)在2*10^6cell/ml;懸浮細(xì)胞可以在轉(zhuǎn)染當(dāng)天接種/鋪板(細(xì)胞計(jì)數(shù)大約5*10^4cell/ml),待細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定后做轉(zhuǎn)染前細(xì)胞密度30-40%。2.為了能在使用時(shí)有較好的轉(zhuǎn)染效果,靠前次使用建議您用24孔板做,每孔2ul轉(zhuǎn)染試劑即可。將較佳轉(zhuǎn)染條件(siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的用量、比例)放大到對(duì)應(yīng)的孔板即可。原代細(xì)胞是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。金華...
原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)要點(diǎn):轉(zhuǎn)染過(guò)程不可添加物品,否則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡;開(kāi)始實(shí)驗(yàn)siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM、30nM、50nM、100nM進(jìn)行摸索,后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果修改。RFectPM可用來(lái)轉(zhuǎn)染siRNA、antisenseRNA、microRNA等200bp以?xún)?nèi)的小分子RNA和DNA,可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細(xì)胞。對(duì)于大多數(shù)原代細(xì)胞,RFectPM的細(xì)胞轉(zhuǎn)染陽(yáng)性率都在80%以上,而轉(zhuǎn)染細(xì)胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡(jiǎn)便,先將sRNA與RFectPM室溫混合,再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細(xì)胞,血清對(duì)轉(zhuǎn)染效果沒(méi)有影響,不必刻意添加或更換培養(yǎng)液。較為嚴(yán)格...
細(xì)胞傳代的方法都有哪些:根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代;部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。原代培養(yǎng)的開(kāi)始傳代應(yīng)注意的問(wèn)題?細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng),不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理,并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞;吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷;開(kāi)始傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些,使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新...
膠原酶的配制:建議看相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進(jìn)行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱(注意現(xiàn)用現(xiàn)配)。胰酶(酶聯(lián)合法獲取原代細(xì)胞中會(huì)加入胰酶,相關(guān)文章也蠻多的)膠原酶消化時(shí)間:根據(jù)組織特性,消化時(shí)間會(huì)有差異。以小鼠腎細(xì)胞為例,加入膠原酶Ⅰ進(jìn)行消化后,放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,期間每10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎完全消失為止(若是組織塊剪得非常細(xì)小,時(shí)間可以短一些,30min左右即可)。原代細(xì)胞的獲取:酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶。盡快使接種的細(xì)胞貼壁,是決定培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵。寧波貴陽(yáng)原代細(xì)胞分離試劑盒細(xì)胞傳代的方法都有哪些:根...
保存條件:-20℃保存,一年有效。其中臺(tái)盼藍(lán)染色液也可以4℃保存,PMSF(晶體)和PMSF(溶劑)在配制成100mMPMSF溶液前可以室溫保存。注意事項(xiàng):1.試劑盒中的試劑對(duì)于不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟槐厝渴褂谩?.如果不是用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中不必加入PMSF。3.如果用于制備線(xiàn)粒體蛋白樣品,線(xiàn)粒體分離試劑和線(xiàn)粒體裂解液中需添加PMSF。PMSF一定要在線(xiàn)粒體分離試劑或線(xiàn)粒體裂解液加入到樣品中前4.2-3分鐘內(nèi)加入,以免PMSF在水溶液中很快失效。5.分離線(xiàn)粒體的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行,所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。6.通常在分離線(xiàn)粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600...
原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng):1.收到細(xì)胞時(shí),要鏡下觀察是否有污染情況;收到細(xì)胞的前幾天,要做好各種倍數(shù)的鏡下拍照記錄,以防細(xì)胞出現(xiàn)問(wèn)題后,可以跟公司很好地溝通。2.收到細(xì)胞后,不要馬上處理。應(yīng)置于培養(yǎng)箱中靜置4h以上再操作。如果不著急,可靜置過(guò)夜。3.細(xì)胞的靠前次傳代,一定要密度高一些傳代,原代細(xì)胞傳代密度低,很難長(zhǎng)起來(lái)。建議1:2-1:3傳代。4.原代細(xì)胞傳代時(shí)(內(nèi)皮細(xì)胞,貼壁為例),0.25%+0.53nM的胰酶消化,1ml消化液37度培養(yǎng)箱內(nèi)消化30sec,再加入5ml培養(yǎng)基(正常消化貼壁細(xì)胞,我們使用胰酶和培養(yǎng)基的量是1:1,但是原代細(xì)胞必須用大量培養(yǎng)基中和胰酶)。5.原代細(xì)胞不建議凍存,因...
細(xì)胞傳代的方法都有哪些:根據(jù)不同的細(xì)胞采取不同的方法。貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用消化法傳代;部分貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。原代培養(yǎng)的開(kāi)始傳代應(yīng)注意的問(wèn)題?細(xì)胞沒(méi)有生長(zhǎng)到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞多為混雜生長(zhǎng),不同的細(xì)胞有不同的消化時(shí)間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時(shí)處理,并根據(jù)不同細(xì)胞對(duì)胰蛋白酶的耐受時(shí)間而分離和純化所需要的細(xì)胞;吹打細(xì)胞時(shí)動(dòng)作要輕巧盡可能減少對(duì)細(xì)胞的損傷;開(kāi)始傳代時(shí)細(xì)胞接種數(shù)量要多一些,使細(xì)胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細(xì)胞生存和增值使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快,否則...
原代細(xì)胞應(yīng)用困局:經(jīng)過(guò)一次傳代后,原代細(xì)胞培養(yǎng)物就會(huì)成為二級(jí)細(xì)胞培養(yǎng)物,也稱(chēng)為細(xì)胞株。然而,盡管稱(chēng)為細(xì)胞株,但其壽命是有限的(除非如前所述永生化)。這種有限的分裂能力體內(nèi)的細(xì)胞相似,一旦細(xì)胞在體內(nèi)完全分化以發(fā)揮其特殊功能,細(xì)胞將停止增殖-這是固有的保護(hù)性衰老過(guò)程。此外,某些原代細(xì)胞有絲分裂后,無(wú)論是在體內(nèi)或體外培養(yǎng)中都不增殖(例如,神經(jīng)元,骨骼肌細(xì)胞,心肌細(xì)胞,周細(xì)胞,終末分化的肝細(xì)胞)。因此,每次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)后,原代細(xì)胞培養(yǎng)都需要再次從新鮮的組織中解離。待細(xì)胞貼壁后,再補(bǔ)足培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。重慶原代細(xì)胞分離試劑盒原代細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng):由于每種原代細(xì)胞培養(yǎng)的條件迥異,而且每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都摸索出自己的培養(yǎng)條...
原代細(xì)胞的小知識(shí):1.解凍原代細(xì)胞對(duì)解凍過(guò)程非常敏感,因此將小瓶置于37℃水浴鍋中,保持并輕輕旋轉(zhuǎn)直到內(nèi)容物剛剛解凍是很重要的。然后應(yīng)立即從水浴中取出小瓶,并轉(zhuǎn)移到無(wú)菌操作臺(tái)。確保您的培養(yǎng)瓶在解凍前已經(jīng)準(zhǔn)備就緒,以便可以立即用于接種細(xì)胞,并置于培養(yǎng)箱中,我們?cè)谑褂胏ellsystems的原代視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞時(shí),復(fù)蘇的時(shí)候沒(méi)有去離心,第二天換個(gè)液就可以。2.傳代原代細(xì)胞有間隙克制接觸不良反應(yīng),所以細(xì)胞不能到達(dá)100%的密度的時(shí)候傳代,一般較有效的建議觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)周期,CellSystems的原代細(xì)胞在細(xì)胞密度達(dá)到85%左右的時(shí)候傳代較佳,當(dāng)生長(zhǎng)至100%匯合時(shí),它就會(huì)衰老。記住,所有的原代細(xì)胞不...
原代細(xì)胞在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有不可替代性作用,市場(chǎng)前景廣闊。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是指直接從機(jī)體取下細(xì)胞、組織和部位后立即進(jìn)行培養(yǎng)。因此,較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),如果是正常細(xì)胞,仍然保留二倍體數(shù)。但實(shí)際上,通常把靠前代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞如何傳代接種:原代細(xì)胞(primaryculturecell)是指從機(jī)體取出后立即培養(yǎng)的細(xì)胞。有人把培養(yǎng)的第1代細(xì)胞與傳10代以?xún)?nèi)的細(xì)統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。原代細(xì)胞不僅普遍應(yīng)用于分子、細(xì)胞生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究,如蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)、細(xì)胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學(xué)研究等,還可應(yīng)用于當(dāng)今熱...
懸浮型原代細(xì)胞:1)必須保持細(xì)胞的懸浮狀態(tài)??梢酝ㄟ^(guò)增加培養(yǎng)液的黏度來(lái)幫助細(xì)胞呈懸浮狀態(tài),如給培養(yǎng)液中加入低濃度的透明質(zhì)酸復(fù)合物。在有攪拌裝置的培養(yǎng)器皿內(nèi)加入培養(yǎng)液是,以5ml為較低限度,否則攪拌時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣泡對(duì)細(xì)胞造成傷害。使用這種方式需注意勿使攪拌速度過(guò)快,否則即可使培養(yǎng)液溢出又容易造成污染。如果培養(yǎng)液的量在5ml以下,可以采用旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。給懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞換液時(shí)要注意不要吸出細(xì)胞2)能夠進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞,其生命力一般都比較旺盛,體外分裂增殖的速度較快,營(yíng)養(yǎng)成分消耗大,換液時(shí)間隔一般較短。并且培養(yǎng)基中需包含細(xì)胞類(lèi)型特定的營(yíng)養(yǎng)因子、生長(zhǎng)因子、葡萄糖和/或物品。南昌正規(guī)原代細(xì)胞分離試劑盒供應(yīng)商原...
原代細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng):原代內(nèi)皮細(xì)胞提?。?)整個(gè)操作要在潔凈通風(fēng)的超凈臺(tái)下進(jìn)行,所有的器材要高壓消毒。2)根據(jù)BALB/c小鼠的體重,用10ml/kg3%濃度的戊巴比妥鈉麻醉;將小鼠置于盛有75%乙醇的燒杯內(nèi),這一步不僅可以消毒,也可以讓小鼠體毛浸濕,后續(xù)剃去皮毛的時(shí)候不會(huì)沾到剪刀或組織上。3)用鑷子輕輕挑起小鼠的心臟,裝有PBS的注射器插入心尖,同時(shí)在右心耳處剪開(kāi)一個(gè)小口,緩慢推動(dòng)注射器,隨著心臟的跳動(dòng),將體內(nèi)的血液沖洗出來(lái)。4)取出小鼠的肺部組織,將肺組織切成小米粒樣的大小,置于預(yù)冷的HBSS中反復(fù)沖洗幾次。5)將小米粒大小的肺組織置于培養(yǎng)瓶中(培養(yǎng)瓶前現(xiàn)在用1%明膠溶液包被培養(yǎng)面,4度過(guò)...